代 渊 任 波 陈 欢 魏江平 任香怡 付文君 徐世军

(成都中医药大学养生康复学院，四川 成都 611137)

肤乐颗粒对大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒作用的拮抗效应及机制

代 渊 任 波1，2陈 欢1，2魏江平1，2任香怡1，2付文君1，2徐世军1，2

(成都中医药大学养生康复学院，四川 成都 611137)

目的观察肤乐颗粒对大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒作用的拮抗效应及机制。方法采用大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒模型，观察肤乐颗粒对大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒率的影响；采用免疫组织化学法观察肤乐颗粒对颅骨Syk、Fyn和COX-2表达的影响。结果肤乐颗粒高、中、低剂量组大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒率显著低于模型组(P<0.05)；肤乐颗粒高剂量组颅骨Syk较模型组显著降低(P<0.05)；肤乐颗粒高、中剂量组颅骨Fyn较模型组显著降低(P<0.05)；肤乐颗粒高、中、低剂量组颅骨COX-2较模型组显著降低(P<0.05)。结论肤乐颗粒具有良好的抗过敏作用，其机制与抑制Src家族非受体蛋白酪氨酸激酶激活有关。

肤乐颗粒；抗过敏；Syk；Fyn；COX-2

老年皮肤瘙痒症至今发病机制不明，一般认为与老年人性腺功能低下，皮脂腺和汗腺分泌功能减退，皮肤干燥和退行性萎缩有关。研究表明过敏因素是老年皮肤瘙痒症诱发和加重的主要因素之一，而Src家族非受体蛋白酪氨酸激酶磷酸化激活在IgE介导的肥大细胞脱颗粒信号转导途径通路具有重要的作用。中医认为本病属于“风痒”、“痒风”、“血风疮”、“谷道痒”等范畴，病机主要责之于血燥生风，肤乐颗粒由制首乌、白鲜皮、赤芍、当归等7味中药组成的专利处方，具有滋阴润燥，养血祛风的功效，临床适用于老年皮肤瘙痒症，症见皮肤干燥瘙痒或肌肤灼热、情绪烦躁或入夜尤甚或(及)此起彼伏，舌红苔少或干，脉弦细或弦细数。本研究对肤乐颗粒抑制肥大细胞脱颗粒作用及机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1药物及试剂 肤乐颗粒(1.67 g原生药/g)，由成都中医药大学中药炮制与制剂系提供，批号：140715；马来酸氯苯那敏片(扑尔敏)，太极西南药业有限公司生产，批号：120308。卵白蛋白，Sigma产品；百白破疫苗，武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：20131047-2。甲苯胺蓝(进口分装)，批号：120418，上海如吉生物科技发展有限公司。Syk一抗，兔多克隆抗体，批号：bs-0685R，北京博奥森生物技术有限公司；Fyn一抗，兔多克隆抗体，批号：bs-13236R，北京博奥森生物技术有限公司；COX-2一抗，兔多克隆抗体，批号：bs-0732R，北京博奥森生物技术有限公司。

1.2实验动物 雄性SD大鼠，体重(200±20)g，SPF级，成都达硕实验动物有限公司提供，合格证号为：SCXK(川)2013-24。

1.3试验仪器 转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)；图像分析软件Motic Images Advanced。

1.4抗血清制备 取(100±10)g雄性SD大鼠5只，两后肢肌肉注射1%卵白蛋白溶液0.5 ml/只，同时腹腔注射百白破疫苗0.5 ml/只，隔日重复致敏一次，共3次。末次致敏13 d后大鼠腹主动脉取血，3 500 r/min，离心10 min，分离血清并合并，-20℃保存备用。

1.5分组及给药方法 另取SD大鼠60只，体重(200±20)g，按体质量随机分为空白对照组、模型对照组、马来酸氯苯那敏片组(扑尔敏，5 mg/kg)、肤乐颗粒高(14 g原生药/kg)、中(7 g原生药/kg)、低(3.5 g原生药/kg)剂量组，每组10只，给药，10 ml/kg，1次/d，连续6 d。给药第4天大鼠头部皮下注射抗血清0.1 ml/只致敏，注射48 h后各组大鼠尾静脉注射用0.5%伊文思蓝溶液配成2 mg/ml的卵白蛋白溶液攻击，注射量10 ml/kg。30 min后断头处死大鼠。

1.6颅骨肥大细胞脱颗粒观察 常规方法制备颅骨膜骨切片，切片脱蜡复水后在甲苯胺蓝溶液染色30 s，蒸馏水洗2次，每次3～5 min，30%酒精分色，在镜下控制分色时间，以肥大细胞异染颗粒呈紫色为宜。每只大鼠切片选取3个400倍视野，计数肥大细胞总数和脱颗粒数目(包膜出现明显破裂或有颗粒外逸为脱颗粒)，将相应数值平均即为该点400倍镜下局部肥大总数和脱颗粒数目。按下式计算肥大细胞脱颗粒率：脱颗粒率(%)=肥大细胞脱颗粒数目/肥大细胞数×100%。

1.7免疫组化法检测颅骨Syk、Fyn和COX-2表达 采用S-P 法进行免疫组化操作。大鼠颅骨常规制片、脱蜡后灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后滴加山羊血清封闭，滴加稀释的一抗(1∶200)4℃过夜，PBS(pH 7.2～7.4)洗3次后滴加二抗封闭，DAB显色后苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统进行图像分析，每例标本测3张切片，每张切片的每个测定部位随机选取三个视野，取平均值。所有平均光密度(IA)值测定均在相同的光学条件下完成。

1.8统计学方法 采用SPSS13.0软件进行One-way ANOVA结合Post Hoc检验。

2 结 果

2.1肤乐颗粒对大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒的影响 大鼠颅骨切片镜下背景为淡蓝色或无色，肥大细胞胞质呈蓝色，胞核为无色，肥大细胞多在硬脑膜血管周围分布，少数大鼠硬脑膜血管周围胞质中可见粗大的蓝紫色或紫红色颗粒；模型组切片背景色与空白对照组一致，每只大鼠硬脑膜血管周围可见大量脱颗粒的肥大细胞，分布面广、密集，平均光密度值较空白对照组显著增高(P<0.01)；扑尔敏组染色较模型组浅，分布面积小且分散，平均光密度较模型组显著降低(P<0.05)，肤乐颗粒高、中、低剂量组染色较模型组浅，每只大鼠硬脑膜血管周围可见少量脱颗粒的肥大细胞，分布面积小而分散，平均光密度值较模型组显著降低(P<0.05)。见图1，表1。

2.2肤乐颗粒对大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒模型颅骨Syk表达的影响 Syk主要分布在细胞膜，成浅黄色或棕黄色颗粒见图2。模型组大鼠颅骨Syk较空白对照组显著高表达，着色较深，平均光密度值显著增高(P<0.01)。扑尔敏组Syk较模型组显著低表达，平均光密度显著降低(P<0.05)。肤乐颗粒高剂量组Syk较模型组显著低表达，着色较浅，平均光密度值亦显著降低(P<0.05)，肤乐颗粒中、低剂量有下降趋势。见表1。

图1 各组大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒的比较(甲苯胺蓝染色 ，×400)

图2 各组颅骨Syk表达(DAB,×400)

2.3肤乐颗粒对大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒模型脑膜颅骨Fyn表达的影响 Fyn主要分布在细胞膜，成浅黄色或棕黄色颗粒。模型组大鼠颅骨Fyn较空白对照组显著高表达，分布面积较广，着色较深，平均光密度值显著增高(P<0.01)。扑尔敏组Fyn较模型组显著低表达，平均光密度显著降低(P<0.05)。肤乐颗粒高、中剂量组Fyn较模型组显著低表达，分布面积较窄，着色较浅，平均光密度值亦显著降低(P<0.05)，肤乐颗粒低剂量组Fyn有下降趋势，见图3，表1。

2.4肤乐颗粒对大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒模型脑膜颅骨COX-2表达的影响 COX-2主要分布在细胞质、核膜或间质，成浅黄色或棕黄色颗粒见图4。模型组大鼠颅骨COX-2较空白对照组显著高表达，分布面积较广，着色较深，分布比较集中，平均光密度值显著增高(P<0.01)，扑尔敏组较模型组COX-2显著低表达，平均光密度显著降低(P<0.05)。肤乐颗粒高、中、低剂量组COX-2较模型组显著低表达，分布面积较窄，着色较浅，平均光密度值亦显著降低(P<0.05)。见表1。

图3 各组颅骨Fyn表达(DAB,×400)

图4 各组颅骨COX-2表达(DAB,×400)

组别脱颗粒率(%)SykFynCOX⁃2空白对照组6．36±7．792)0．303±0．0192)0．310±0．0132)0．284±0．0052)模型组49．41±3．000．329±0．0100．341±0．0170．331±0．022扑尔敏组29．07±6．132)0．304±0．0142)0．325±0．0151)0．288±0．0082)肤乐颗粒高剂量组23．93±7．652)0．309±0．0181)0．320±0．0132)0．289±0．0072)肤乐颗粒中剂量组28．70±5．422)0．314±0．0110．326±0．0161)0．303±0．0092)肤乐颗粒低剂量组43．16±5．941)0．313±0．0130．339±0．0170．297±0．0052)

与模型组比较：1)P<0.05,P<0.01

3 讨 论

老年皮肤瘙痒症临床患病率高达40.7%〔1〕，其发病与过敏原尤其是与吸入性过敏原有关〔2〕。肥大细胞作为过敏反应的主要效应细胞，其脱颗粒释放过敏性介质是导致过敏效应放大的关键机制。IgE介导的信号途径、酪氩酸激酶(Lyn)依赖的激活途径和Fyn依赖的激活途径是三条肥大细胞脱颗粒的关键途径〔3〕。肥大细胞表面具有高亲和力IgE受体FcεRⅠ，可通过非IgE依赖的非免疫性激活和IgE依赖的免疫激活两种方式激活。研究表明酪氨酸激酶Lyn是FcεRⅠ交联后第一个被激活的激酶，Lyn激活之后通过磷酸化γ-I-TAMs激活Syk〔4〕。因此认为Lyn、Syk是细胞活化脱颗粒IgE/FcεRⅠ介导的信号通路的源头按钮，Lyn和Syk的激活可进一步激活下游多条信号通路，引起胞内钙离子浓度的升高，诱导炎症介质的合成与释放，最终导致细胞活化脱颗粒。此外，受体的聚集交联之后亦可激活Fyn，进而激活Fyn依赖的Gab2，激活的Gab2随后引起磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶C(PKC)的活化〔5〕，通过激活下游通路引起过敏介质的合成和释放。研究表明即使在FcεRI，Syk，LAT和ERK2仍然发生磷酸化的情况下，Fyn 的缺失会破坏PIP3 的活化和肥大细胞的脱颗粒〔5〕。由此可见，Src 家族非受体蛋白酪氨酸激酶(PTKs)Syk和Fyn在肥大细胞脱颗粒信号途径中扮演着细胞信号中转和下游“放大器”的角色。此外，在Lyn-Syk 激酶依赖的肥大细胞脱颗粒信号途径过程中，花生四烯酸的代谢产物也被激活，调节MAPK和PLA2〔6〕。一旦PLA2 激活便转位至细胞膜，肥大细胞继而释放花生四烯酸并且募集白三烯和前列腺素。COX-2是花生四烯酸代谢过程中的关键酶，在前列腺素类介质的生成中具有重要作用。本研究结果说明肤乐颗粒具有拮抗模型大鼠颅骨肥大细胞脱颗粒的作用，其机制与抑制Src家族非受体蛋白酪氨酸激酶激活和抑制前列腺素类过敏介质的生成和释放有关。

1彭学标.老年人的瘙痒性皮肤病〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2000；14(3)：173-4.

2吴跃申，水润英，徐琴言，等.老年皮肤瘙痒症患者血清特异性IgE的检测分析〔J〕.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2004；3(2)：89-90.

3李 敏，周 建，蒋春雷.IgE 介导的肥大细胞脱颗粒信号转导途径的研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2009；9(18)：3539-42.

4Beavitt SJE，Harder KW，Kemp JM，etal.Lyn-deficient mice develop severe，persistent asthma：Lyn is a critical negative regulator of Th2 immunity〔J〕.J Immunol，2005；175(3)：1867-75.

5Parravicini V，Gadina M，Kovarova M，etal.Fyn kinase initiates complementary signals required for IgE-dependent mast cell degranulation〔J〕.Nature Immunol,2002；3(8)：741-8.

6Hamawy MM，Mergenhagen S，Eand Siraganian R，etal.IgE-dependent mast cell activatidion：protein tyrosine phosphorylation as a mechanism of signaling in mast cells and basophils〔J〕.Cell Signal，1995；7：535-44.

〔2016-04-11修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

四川省科技支撑项目(No.2014SZ0071-09)；四川省苗子工程项目(No.2014-095)

徐世军(1975-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事中药药理学研究。

代 渊(1975-)，女，博士，副教授，主要从事中医老年性疾病研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)16-3911-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.002

1 四川省中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地

2 成都中医药大学药学院