周静，张娜娜，张一望，邵春奎（中山大学附属第三医院病理科，广东省肝脏疾病研究重点实验室，广东 广州 510630）

肝移植术后的慢性排斥反应（chronic rejection，CR） 是由细胞和体液介导的免疫反应并且是由多种因素共同参与而引起的一种慢性肝移植物损伤，尽管各种新型免疫抑制剂的临床应用和抗排斥治疗方案日臻完善，其发生率已由20世纪80年代的15%～20%降至目前的不足2%［1-2］，但CR仍是影响移植肝长期存活以及导致肝功能丧失的重要因素。因此， 对肝移植术后CR及时并准确地诊断具有重要的临床意义，也是肝移植病理学目前研究的重要内容之一。本研究旨在回顾性观察16例肝移植术后CR病理组织学资料，总结分析其病理特点。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集中山大学附属第三医院2005年1月-2016年12月16例肝移植患者术后经病理证实为CR的肝穿刺活检组织学资料。全部病例均符合以下条件：① 肝穿刺活检组织显微镜下见到连续3个以上汇管区；② 临床及实验室资料完整，其中男性14例，女性2例；年龄35～64岁，平均（44.75±8.98）岁；原发病的病理诊断：乙型肝炎肝硬化3例；肝恶性肿瘤7例；慢性重型乙型肝炎5例；酒精性肝硬化1例。术后免疫抑制剂以糖皮质激素、他克莫司（或环抱素A）及硫唑嘌呤为基础用药。定期做血生化检查〔肝功能检查、乙肝抗原和抗体的血清学检查、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）血清学检查等〕及影像学辅助检查。

1.2 方法

1.2.1 苏木素-伊红（HE）染色：移植肝穿刺活检组织迅速经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，常规HE染色。依照国际统一的Banff标准方案对CR进行分级及评分［3］。

1.2.2 免疫组织化学染色：部分病例加做乙型肝炎表面抗原（hepatits B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）、CMV及CK7免疫组化染色，采用Envision两步法进行（具体步骤略）。鼠抗人HBsAg单克隆抗体、兔抗人HBcAg多克隆抗体及鼠抗人CK7单克隆抗体均购自DAKO公司，工作浓度分别为1：50、1：900及1：100；鼠抗人CMV单克隆抗体购自福建迈新公司，工作浓度为1：50；鼠抗人HCV单克隆抗体购自上海长岛公司，工作浓度为1：50；抗体稀释液及Envision试剂盒均购自DAKO公司。

2 结 果

2.1 穿刺时间：移植术后187～3490天，平均穿刺时间为985天。

2.2 早期组织学表现（图1）：早期表现为汇管区轻度扩大，较为单一的少到中等量淋巴细胞及单核细胞浸润，中性粒细胞及嗜酸性细胞少见，少数小叶间胆管管腔变形，上皮细胞空泡变性、核极向紊乱、细胞固缩或嗜酸性变，小胆管数量未见明显减少（图1a）。小叶间动脉管腔狭窄变形、内皮细胞增生肿胀、细胞核极向紊乱， 小动脉数量无减少（图1b）。部分中央静脉周围淋巴细胞及单核细胞浸润伴肝细胞变性、坏死及脱失，肝细胞胞浆内胆色素沉积及毛细胆管胆栓形成（图1c），库普弗细胞增生伴含铁血黄素颗粒沉积（图1d）。

图1 a.门管区小叶间胆管管腔变形，上皮细胞嗜酸性变、核深染、多形，伴少量淋巴细胞及单核细胞浸润，周围肝细胞水样变性伴少量胆色素沉积；b.小动脉管腔狭窄，内皮细胞增生、肿胀变性；c.中央静脉及周围淋巴细胞、转化淋巴细胞及单核细胞浸润伴周围肝细胞变性、淤胆和肝细胞脱失,形成小叶中央坏死性炎症；d.库普弗细胞增生、含铁血黄素颗粒沉着

2.3 晚期组织学表现（图2）：晚期则表现为中央静脉及周围炎症减轻，纤维组织增生。肝细胞及毛细胆管淤胆明显。汇管区炎症细胞减少， 纤维组织增生， 可见桥接纤维化及纤维间隔形成（图2a、图2b）。小叶间胆管及小叶间动脉数量减少或消失（图2c）。

图2 a.汇管区小叶间胆管上皮明显变性、坏死，胆管周围纤维化，炎症细胞浸润不明显；b.汇管区纤维组织增生、桥接纤维化；c.汇管区小胆管及小动脉减少、消失

3 讨 论

肝移植是治疗各种病因所致终末期肝病的有效手段［4-6］。肝移植术后CR表现为移植术后数月或数年后逐渐出现的移植肝功能减退甚至衰竭，决定其发生的因素可能包括高龄供体、长时间的冷热缺血、反复或持续存在的急性排斥反应（acute rejection， AR）、CMV感染以及免疫抑制剂的应用不足等，多数人认为同种抗原诱导的免疫反应在CR的发病过程中起最重要的作用［7-8］。

肝移植术后发生CR并不具有确定的时间界限，多数CR发生在术后1年之内，术后的2～6个月为高峰， 也可发生于移植术后数周内或1年以后。因此，有人认为CR是一个形态学概念，并非完全依据时间而定，慢性排斥反应中的“慢性”二字实际上是指非可逆性病理改变。本组资料显示最早的CR发生于移植术后6个月，而最迟的则接近10年。

CR的基本组织病理学改变包括小胆管病变（胆管上皮萎缩老化，累及多数胆管，伴或不伴至少50%的胆管缺失）和泡沫细胞阻塞性动脉病。由于肝穿刺活检取材固有的局限性（难以检见大的肝动脉）， 因此，病理检查只能通过多次穿刺活检来提供渐进性的胆管丢失作为主要依据［3，9］。

本研究显示小胆管损伤或消失是CR最常见的病理特征，涉及的可能机制主要有两个，包括直接的细胞毒性免疫损伤以及缺血性损伤，也可能两者都在特定的情况下具有重要作用［10］。组织学表现为小胆管的管腔变形，内衬上皮细胞不连续、间距增大或极向紊乱，细胞呈现退行性改变，表现为核深染、多形，核浆比增大或固缩、胞浆嗜酸性变或空泡变性等萎缩老化现象。CR早期，小胆管数量无明显减少或仅在少数汇管区内（＜50%）见到胆管消失， 而绝大多数汇管区内小胆管可见炎性损害和上皮细胞的退行性改变，且见不到明显的细胆管反应及小胆管增生［9］。随着病程进展，小叶间胆管出现丢失，而且是一个从几周到数月的渐进性过程，可累及所有的小叶间胆管，但以直径＜60 μm的小胆管更易受累。如果超过50%门管区见不到小胆管，提示CR可能已经进入晚期，且具有诊断意义，很多诊断明确CR有超过75%的门管区出现胆管丢失，即使胆管丢失明显，大多无明显的胆管增生及门管区扩大，这是与其他胆管丢失性疾病不同之处。有时损伤的胆管常表现为成群或成束的上皮细胞聚集，难以辨别，可通过Masson三色、PAS染色或免疫组化（CK7、CK19）来帮助鉴别［11］。此外，由于小胆管常与相应大小的肝动脉分支伴行，胆管丢失也可依据门管区内小动脉分支有无相伴随的胆管加以识别，即根据一个门管区内动脉分支和小胆管的数量比例进行评估［10］。

门管区炎症细胞浸润也是CR的常见病理特征，因为CR由细胞与体液免疫共同参与， 也可出现细胞免疫所致的病理改变， 且部分CR多由AR引起。在CR早期，门管区可见轻至中度淋巴细胞、单个核细胞及浆细胞浸润，加上胆管损伤性改变，类似于AR的病理表现，但CR较少出现嗜酸粒细胞浸润，临床对额外免疫抑制剂的反应欠佳，可资鉴别。随着病程进展，炎症细胞浸润逐渐减少，这是由于免疫攻击的主要靶器官即小叶间胆管消失后，炎症细胞失去攻击目标而造成。本研究显示，多数门管区的炎症细胞浸润均较轻微，这种胆管损伤的严重性与炎细胞浸润的程度不成比例也是CR的病理特征之一。CR特征性的血管病变主要累及大或中等大小的动脉，表现为典型的泡沫细胞性动脉病变，即巨噬细胞及内膜细胞形成泡沫细胞在内皮下沉积［12］。由于泡沫细胞性动脉病变主要发生于近肝门的较大动脉支，在肝穿活检中难以见到，除非是再次移植的全肝标本，否则其诊断价值有限。本研究仅偶见门管区小叶间动脉损伤，表现为管壁增厚、透明变性或内皮细胞肿胀、变性，未查见典型泡沫细胞性动脉病变。

由于肝动脉病变而导致肝组织缺血、缺氧和胆管损伤后造成淤胆性损害以及免疫损害等多种因素共同作用下，肝细胞出现变性、坏死及脱失，多发生在中央静脉周围（肝腺泡Ⅲ区），并伴有肝细胞及毛细胆管淤胆现象，且淤胆的程度与小叶间胆管损害及减少程度密切相关，中央静脉周围出现胶原纤维沉积、少量淋巴细胞和单核细胞浸润，呈中小叶中央坏死性炎症的病理改变，发生上述改变的小叶中央区域通常被认为是缺血性区域，其病变程度间接反映了动脉、胆管及免疫损伤程度，随着CR发生时间延长而加重，是提示CR的重要组织学依据。本组资料中尚查见肝窦内库普弗细胞增生伴含铁血黄素颗粒沉积，可能对CR的发生也起到了一定的效应作用［13］。随着CR的持续存在， 坏死区发生纤维化加上门管区小胆管丢失明显时常伴有纤维化，继而可形成桥接纤维化和纤维间隔，此时门管区较少或没有炎症细胞的浸润，提示CR已经进入不可逆的阶段。

总之，小叶间胆管上皮退行性改变及数量进行性减少对CR最具诊断价值，而小叶中央坏死性炎症变及汇管区单一炎症细胞浸润则对早期CR具有提示作用， 肝组织内出现明显的纤维化或纤维间隔形成时则提示CR已经进入晚期不可逆的阶段。CR需要与表现为门管区炎症、胆管损伤及胆管丢失的疾病进行鉴别，包括病毒性肝炎复发（特别是丙型肝炎）、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性胆管炎及缺血性胆管炎等，均是CR需要鉴别的对象，此时需通过观察门管区有无显著扩大、浸润的炎症细胞类型，有无小胆管增生或中央静脉周围炎症等病理特点，结合临床表现、免疫抑制剂血药浓度、血清病毒学、自身免疫抗体检查以及影像学观察肝内外胆管有无扩张等情况进行综合分析。对CR的诊断需要特别谨慎，以避免假阳性的结果，用多次连续性的标本进行动态观察，可以提供更为确切的信息并尽可能地减少样本误差，因为门管区越多就越能代表肝脏的整体情况，也更能与临床资料密切联系，为临床调整免疫抑制治疗提供帮助［14-15］。