王蕊

摘要：本文主要针对发酵过程进行分析，明确了在发酵的过程中葡萄糖在线检测系统的研制方法。从发酵的需求出发，针对葡萄糖在线检测系统的研究的需求以及研发的过程中的思路和具体的方法进行总结，希望能够为今后的葡萄糖发酵在线检测系统的研发和应用带来参考。

关键词：发酵过程，葡萄糖，在线检测提供

前言

在发酵的过程中，很多时候对葡萄糖需要进行进一步的检测，所以我们必须要研究葡萄糖在线检测系统，目的在于进一步的分析葡萄糖的数量以及在应用的过程中需要关注的要点，只有这样才能够真正的检测到位。

1、葡萄糖是发酵过程概述

发酵工程是生化工程和现代生物技术及其产业化的基础，随着发酵技术的不断发展，对发酵过程测控系统的要求也越来越高。然而，生物发酵过程机理复杂，具有高度的非线性、时变性，发酵过程中的生物参量是关键的过程参量，由于受其测量水平的限制，难以实现在线测量，导致先进控制方法只能停留在理论探讨上，难以在发酵过程中应用。

至今为止，生物反应过程控制依赖于pH值、温度（T）、紫外线（OD）等传感器测得的少数物理参数，由控制专家经过数学建模对生物反应过程进行过程曲线拟合，对生物反应体系而言，就是在线分析检测。在线调控主要受制于生化反应系统的复杂性，易造成生化反应中生物信息无法及时得到。复杂性体现在：（1）菌体生长和代谢的机制模糊以及发酵系统所包含的参数多，且为时间函数；往往包含气、液、固三相体系；（2）发酵系统经常要求保持无菌，高温灭菌会严重破坏生物传感器生物活性物质如酶的活性；发酵时pH、温度等条件与生物传感器上酶测定条件不符造成的测量偏差；发酵液的底物浓度往往超出传感器线性范围；（3）膜长期与底物接触活性下降，使电极寿命缩短等。因此，在生化反应体系中实现在线检测生物、化学量的分析系统尚未见报道。

葡萄糖是发酵过程中菌体生长和产物合成的主要碳源，但必须控制其在发酵液中的浓度。在发酵前期，如果葡萄糖浓度过高，容易对菌体生长产生阻遏、抑制和限制作用；在发酵后期，如果葡萄糖浓度过低，则会限制菌体生长和产物合成。需特别注意的是流加的葡萄糖量，即使是超出最适浓度范围的微小波动都将引起严重的阻遏或限制。在发酵过程中，为了防止染菌，发酵罐等设备需要经过高温蒸气灭菌，这会导致常用的“酶膜式”葡萄糖生物传感器所用的生物酶的活性下降或丧失。因此，葡萄糖浓度一般都通过在实验室离线化验取样样本获得。依据测定结果实施间歇式的补料，而间歇式补料容易引起糖浓度的剧烈变化，造成罐内环境（如渗透压）不稳定，从而对菌体代谢活性及最终发酵生产带来负面影响，进而影响发酵的产率和质量。因此，葡萄糖在线测量仪器的研制具有重要意义。

与常见葡萄糖检测方法，如菲林滴定法、氧化酶-偶联比色法（GOD-POD法）、气相色谱法、高效液相色谱法及气相色谱-质谱法相比，葡萄糖氧化酶-电极法具有特异性强、适于在线、分析速度快等优点。因此，以葡萄糖氧化酶-电极法为原理的葡萄糖酶电极生物传感器（以下简稱为葡萄糖生物传感器）及以葡萄糖生物传感器为核心部件的葡萄糖分析仪均得到了广泛地研究与应用。例如，美国YSI公司的YSI2300STATPLUS葡萄糖乳酸分析仪、德国EKF公司的BIOSENC_Line葡萄糖/乳酸分析仪和中国山东省科学院生物研究所研制的SBA系列生物传感分析仪，均采用“酶膜”方式葡萄糖生物传感器，主要用于医疗血糖及发酵工业葡萄糖的离线测量，由于酶的生物活性经高温灭菌会失活，因此“酶膜”方式葡萄糖生物传感器不能与发酵罐直接连接，导致不能在线使用。瑞典ChemelAB公司的SIRE系列葡萄糖分析仪，采用“识别物质注射”方式葡萄糖生物传感器，主要用于食品、发酵工业葡萄糖的离线测量。该生物传感器采用的探头方式，通过透析膜将传感器与待测液隔开。如果将探头插入发酵罐中，注射的酶液、流入的缓冲液以及酶促反应后的废液将会污染发酵液，因此不能直接插入发酵罐中进行葡萄糖浓度的在线测量。而Min等利用在线FIA结合微透析取样和双生物传感器，实现了发酵过程葡萄糖和L-乳酸的同时监测。

2、发酵过程葡萄糖在线检测系统的研制

本研究构建了发酵过程的葡萄糖在线检测系统（以下简称为检测系统）。其中，研制的新型酶注射式葡萄糖生物传感器，能够承受高温蒸气灭菌，并因采用“新鲜”酶液，而不用频繁校准，其对葡萄糖的灵敏度达到0.259nA/（mg/L）；检出限为0.7mg/L。对于500mg/L葡萄糖浓度测量结果CV值为2.02%；自行设计的透析取样系统实现了检测系统的在线取样，同时减少了待测液的消耗。通过相关实验研究，验证了此检测系统应用于葡萄糖浓度在线测量的可行性。

2.1仪器与试剂

SBA-40E葡萄糖生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）。葡萄糖标准液，来自山东省科学院生物研究所。磷酸盐缓冲液，由山东省科学院生物研究所SBA系列分析仪专用缓冲剂添加蒸馏水配制。葡萄糖氧化酶液，由葡萄糖氧化酶（型号G7141，312U/mg，美国Sigma公司）添加磷酸盐缓冲液配制。

2.2葡萄糖在线检测系统

本研究构建的葡萄糖在线检测系统结构如图1所示。系统主要由透析取样系统、酶液定量注射装置、酶注射式葡萄糖生物传感器、三电极检测电路（即恒电位仪电路）和DSP数据采集电路等组成。

系统工作过程如下：首先透析取样探头从待测场合（如发酵罐）中提取待测液（如发酵液），并通过待测液定量注射装置将待测液定量注射入酶注射式葡萄糖生物传感器。与此同时，酶液定量注射装置也将定量的葡萄糖氧化酶注射入传感器。葡萄糖与葡萄糖氧化酶在三电极检测电路系统作用下发生酶促反应，产生与待测液中葡萄糖浓度成比例的电流信号。电流信号经过DSP数据采集电路和上机位采集并存储。

2.3酶注射式葡萄糖生物传感器

发酵过程中葡萄糖的在线检测要求所使用的检测系统能够承受在线的高温蒸气灭菌。因而研制了耐高温的新型酶注射式葡萄糖生物传感器，其作为检测系统的核心部件，采用了非固定化酶方式[12，20]。酶注射式葡萄糖生物传感器的结构如图2A所示。其中三电极装置的工作电极、对电极和参比电极分别采用Pt，Ag和Ag/AgCl电极制成，而反应池的外结构体及电极体均采用耐高温的PEEK材料制成。

酶注射式葡萄糖生物传感器使用的是外来注射的酶液，而非传统的需安装在电极表面的酶膜，即所研制的传感器本身不含具有生物活性的酶。另外，所研制的传感器和透析取样系统所用材料均耐高温，因此检测系统可以始终保持与待测场合（如发酵罐）相连接，即使待测场合（如发酵罐）的温度很高时，对此传感器也无损害和影响，故可实现复杂过程（如发酵过程）下葡萄糖浓度的在线测量。

3、结束语

综上所述，发酵过程中，葡萄糖在线检测系统的应用也是非常重要的，在应用这些检测系统的时候要更好地明确其应用流程，并且积极总结应用过程中存在的问题，及时的进行改进和完善。

参考文献：

[1]朱湘临，刘叶飞，孙谧，王跃军.海洋微生物酶反应器智能控制系统的研制[J].农业工程学报.2015（09）：34

[2]王建林，赵利强，于涛.利用状态空间模型和不敏卡尔曼滤波的分批补料发酵过程在线估计（英文）[J].ChineseJournalofChemicalEngineering.2016（02）：12endprint