金显文， 陈静静

(淮北师范大学 生命科学学院， 淮北 235000)

双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的急性联合毒性效应

金显文， 陈静静

(淮北师范大学 生命科学学院， 淮北 235000)

采用静水生物测试法研究了双酚A和苯酚对日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)幼虾单一因子的急性毒性效应，在此基础上，运用毒性单位法研究了双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾联合毒性效应。试验结果表明，双酚A和苯酚的浓度与日本沼虾幼虾的死亡率之间呈显著正相关，随着染毒时间的延长，延长半数致死浓度逐渐降低，且存在较显著的剂量—效应和时间—效应关系。分别作用24 h和48 h，双酚A对日本沼虾幼虾的LC50分别为25.68和12.03 mg/L，苯酚对日本沼虾幼虾的LC50分别为33.63和27.59 mg/L。双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的安全浓度分别为0.80和5.57 mg/L。双酚A与苯酚联合作用24 h和48 h对日本沼虾幼虾的LC50分别为0.97 TU和0.51 TU，TUi均小于1，两者的联合毒性效应都表现为协同作用。

双酚A；苯酚；日本沼虾；联合毒性

双酚A(BPA)普遍存在于水环境中，化学式为C15H16O2，是合成聚碳酸酯和环氧树脂等的原材料，被广泛应用在食品包装和容器内壁涂装中。双酚A在生产和日常使用过程中可通过多种途径污染水环境，并通过食物链作用在生物之间进行传递和富集。双酚A属于内分泌干扰物，微量浓度的双酚A便可对机体的生殖系统和内分泌系统的功能产生各种毒性效应[1-5]，影响基因结构和表达[6-7]，因此双酚A已经被外国列入优先污染物的黑名单[8]。苯酚(Phenol)属于酚类化合物，化学式为C6H5OH，它在防腐剂、杀虫剂和化工合成以及日常使用过程中可通过多种途径流入水体，危害水生生物的繁殖和生存[9]。当苯酚流入天然水域后可感染水生生物，人们在食用鱼、虾等水生生物后会通过食物链作用将苯酚积累在人体中[10]，当其浓度超过生物体自身能够调节的范围时，将会引起机体各方面的变化，对其生长、发育造成危害[11-13]。日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)又名河虾，隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、长臂虾科、沼虾属，肉鲜营养价值高，是我国重要的淡水养殖虾类[14]。近些年来，国内外已有大量关于双酚A与苯酚对水生动物的毒性研究，但多集中于单一毒性实验以及双酚A与其他酚类化合物的联合毒性作用方面[9-19]，而有关双酚A与苯酚联合毒性效应则未见报道。本研究以日本沼虾幼虾为受试生物，在单一毒性试验的基础上通过双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的联合毒性效应研究，以期探讨酚类化合物对水生生物的联合毒性作用规律，为自然水域污染防治和人类健康及生态系统安全的科学评价提供参考。

1 材料和方法

1.1 受试生物

日本沼虾幼虾于2015年3月上旬购于淮北市农贸市场，在实验室培养缸内驯养1周，使其适应环境条件。试验时挑选体长 3.1～3.4 cm、体重0.85～0.95 g，健康活泼的个体。

1.2 测试液的配置

双酚A(BPA)为白色针状晶体，分子量为228.29，化学纯；苯酚为白色晶体，分子量94.11，分析纯，两者均购买于国药集团化学试剂有限公司。双酚A难溶于水，以0.01‰的丙酮作为助溶剂，用暴晒过的自来水配制100 mg/L的母液，实验时稀释成所需要的浓度，暴晒的自来水pH约为7.8～8.6。

1.3 单一毒性实验

在正式进行单一毒性实验前进行预试验，确定日本沼虾幼虾分别对双酚A和苯酚2种受试物的最小全致死质量浓度和最大耐受质量浓度。根据预试验结果，试验设置7个浓度梯度，双酚A的浓度梯度分别为：8、12、16、20、24、28和32 mg/L； 苯酚的浓度梯度分别为10、15、20、25、30、35和40 mg/L，各个质量浓度设置3个平行组，每个平行组放12尾日本沼虾幼虾，同时设空白对照。实验开始后，连续观察幼虾的活动、中毒症状；每24 h统计1次日本沼虾幼虾的死亡率，并及时捞出死亡幼虾，在解剖镜下对比观察其鳃和肝脏变化。将受试幼虾沉入水底、玻璃棒触动无反应、心脏停止跳动作为其死亡标志。

1.4 联合毒性实验及其评价

毒性单位这一概念最早由 Sprague等提出，其公式为：TUi=Ci/IC50i。式中，Ci为物质i的质量浓度；IC50i为物质i的半致死或半抑制质量浓度[20]。在单一毒性的基础上，按公式1TU=0.5×24 hLC50(phenol)+0.5×24 hLC50(BPA)，按照0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2和4TU来设定7个质量浓度组进行双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的联合毒性实验，并设置3个平行组和1个空白对照组，若混合后的LC50<1TU，则两者联合毒性的作用方式为协同作用，若LC50>1TU则为拮抗作用，而当LC50=1TU时则为简单的相加作用[21]。

1.5 实验数据统计

试验结果用一元线性回归方程法求得LC50值，SPSS18.0对死亡率数据进行分析统计，计算95%置信区间。

1.6 安全性评价

关于酚类化合物的危害水平及水环境中的定量限研究，采用中华人民共和国国家标准GB5085.3—2007中规定[22]；安全浓度根据Reed Muench法计算[23-24]：SC=48 hLC50×0.3/(24 hLC50/48 hLC50)2。

2 结果

2.1 中毒反应

日本沼虾幼虾在2种受试物中的中毒症状比较相似，由于幼虾对两种试剂的敏感性不同，其反应时间稍有差异，开始时表现狂躁不安，在水中沿烧杯壁乱撞，后逐渐行动受抑。随着染毒时间的增加，活动微弱，最后沉入杯底直至死亡。解剖镜下对死亡个体进行解剖发现，中毒幼虾的鳃和肝脏颜色变深。

2.2 双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的单一急性毒性效应

数据分析结果见表1，日本沼虾幼虾在2种环境污染物中的死亡率与质量浓度之间存在极其显著的相关性(全部P<0.01)；对同一种受试物来说，随着实验时间的延长，日本沼虾幼虾的LC50数值逐渐降低：当试验时间为24 h和48 h时，双酚A的LC50(95%置信区间)数值分别为25.68 mg/L(17.140～38.132)和12.03 mg/L(-1.344～56.738)；苯酚的24 h和48 hLC50(95%置信区间)分别为33.63 mg/L(27.628～41.116)和27.59 mg/L(23.847～31.917)；双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的安全浓度分别为0.80 mg/L和5.57 mg/L。双酚A和苯酚都属于高毒物质，对日本沼虾幼虾的毒性具有明显的剂量—效应关系。对照组中日本沼虾幼虾在实验期间未见死亡。

2.3 双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的联合毒性

在双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的联合毒性实验中，随着试验时间的延长，混合污染物的LC50值均逐渐下降；当试验时间为24 h和48 h时，LC50(95%置信区间)分别0.97 UT(0.091～3.469)和0.51 UT(-0.274～3.106)，均小于1 UT，所以双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾24 h和48 h的联合毒性作用均表现为协同作用，且随着浓度的升高和染毒时间的延长，混合污染物的LC50值在逐渐减小，即代表双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的协同作用逐渐增强。联合作用的安全浓度为0.042 UT(表2)。到实验结束对照组中幼虾的死亡率为6.4%。

表1 双酚A与苯酚对日本沼虾幼虾的单一急性毒性效应

回归方程中x为药物质量浓度；y为日本沼虾幼虾死亡率。下同

表2 双酚A与苯酚对日本沼虾幼虾的联合毒性效应

3 讨论

3.1 双酚A、苯酚单一毒性作用

双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾单一毒性作用均表现为随实验时间的延长死亡率逐渐升高。对照组中未见死亡个体，符合毒性测试的有效性标准[25]。从LC50和SC可看出，双酚A对日本沼虾幼虾的毒性明显大于苯酚。

双酚A是环境雌激素的一种，对肝脏、肾脏和脾肺等器官都具有严重的毒害作用，其进入生物体内后不仅能够致癌而且能够与体内的雌激素受体结合，之后通过多种生化机制产生拟雌激素或抗雌激素的作用，从而干扰生物内分泌系统的正常功能，进而导致各种病变，对生物的生殖、胚胎发育等机体的各方面产生毒害作用[8, 17-18, 26]。研究表明，双酚A对日本沼虾幼虾与隆线溞和微型裸腹溞相比，24 h半致死浓度相当[6]，但比隆线溞和微型裸腹溞24 h和48 h半数致死浓度都略高一些，而萼花臂尾轮虫对双酚A表现得更为敏感[1]，这说明种间敏感性存在差异，日本沼虾外被甲壳，比浮游甲壳动物的体积大、甲壳厚，所以耐受性大[27]。Staples等通过研究双酚A对淡水和海水中的微生物和鱼类的毒理学影响，认为急性毒性试验反应时间为24 h时BPA的EC50值为1000～32×104μg/L[28]，张颖等认为酚类化合物对大型溞的48 h半数致死浓度范围是0.24～27.5 mg/L[29]，本研究中双酚A对日本沼虾幼虾的单一毒性效应结果也属于这个范围之内。

苯酚是原型质毒物，对各种生物有机体都有毒害效应，可通过皮肤和黏膜直接进入血液循环，使细胞被破坏，损害肝、肾功能，出现急性肾功能衰竭，可死于呼吸衰竭，一旦进入环境也会对生态造成危害[30]。这是因为将苯酚与水进行1∶500～1∶1000配置时，此时的水溶液能够将蛋白质沉淀，进而杀死细菌。苯酚对日本沼虾幼虾的安全浓度与锯齿米虾的急性致毒研究的实验结果相当[11]，但明显高于苯酚对脊尾白虾的安全浓度(0.0057 mg/L)[7]，24 h、48 hLC50低于中华鲟稚鱼的97和83 mg/L[19]。这可能与受试生物的种间差异及栖息的环境的pH、温度、光照及营养元素等环境因素不同有关[20]。

3.2 双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的联合毒性

自然条件状况下，在被污染的水体中通常能够同时检测到多种酚类化合物，因此仅以单一污染物的毒性实验所得出的数据来判定多种污染物共存时对水质所造成的毒害是不可取的。所以我们在对天然水域的污染状况进行评判时不仅要测定单一污染物毒性实验的LC50值，而且还要测定多种污染物联合毒性实验的LC50值，这样做对于准确评价混合污染物的毒害作用具有更重要的参考价值[31]。本研究中，在双酚A和苯酚的共同作用下，24 h和48 h的TUi值均小于1，说明二者的联合毒性表现为相互协同，即双酚A和苯酚共存时对日本沼虾幼虾产生的综合毒性大于单一化合物的毒性作用；且TUi值随染毒时间的延长而逐渐变小，说明双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的协同作用逐渐增强。对照组中至实验结束幼虾的死亡率为6.4%，小于10%，符合毒性测试的有效性标准，本试验结果有效[25]。

一般采用毒性单位法、相加指数法和混合指数法来评价联合毒性的作用类型，文献表明：运用相加指数法研究BPA与对硝基酚的联合毒性结果为拮抗作用，因为两者通过竞争位点理论而使联合毒性作用降低[32]；毒性单位法研究双酚 A 和壬基酚对青岛大扁藻的复合效应为相加[33]；在2-氯苯酚与取代苯酚、苯胺类化合物对鲫鱼的联合研究中两种不同方法联合作用类型相同[34]，所以方法不同评价结果可能会有差异。即使同种生物对同种药物的敏感性也会因实验条件、测定方法及受试动物机能状况等因素而有所差异[35]。本研究中双酚A与苯酚对日本沼虾幼虾24 h、48 h的联合毒性均表现为协同作用，这只是基于毒性单位法的评价结果。目前关于联合机制的研究大致可分为生物转化、受体作用、物质间化学反应、功能叠加或拮抗等几个方面[36]。双酚A和苯酚对日本沼虾幼虾的作用机制可以通过邱东茹等在环境刺激素对动物和人体的影响及其作用机制研究中得到启示，虽然单一的酚类化合物活性很低，但2种或2种以上的污染物共同作用于动物或人体时其活性可能会大大提高，产生协同激活的作用[31]，协同作用还可能是由于两者进入机体后，其中一种物质影响了日本沼虾机体对另一物质的吸收、排泄或其他生物转化进程，从而增大了对机体的毒性[37]。双酚A和苯酚协同作用的详细机理还有待于进一步深入研究。

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Joint toxicity of bisphenol A and phenol to the juvenile prawn ofMacrobrachiumnipponense

JIN Xian-wen, CHEN Jing-jing

(School of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China)

A static bioassay test was used to study the cute toxicity of BPA(Bisphenol A) and phenol to the juvenile prawn ofMacrobrachiumnipponens, and based on which, toxic unit (TU) method was used to study the joint toxicity of BPA and phenol toMacrobrachiumnipponense. The results showed that there were significant relationships between the death rate of the juvenile prawn and the concentrations of BPA and phenol. TheLC50decreased gradually with the increasing of the exposure time, and there were significant dose-effect and and time-effect. The 24 hLC50and 48 hLC50of the juvenile prawn to BPA were 25.68, 12.03 mg/L, respectively, and 33.63, 27.59 mg/L to phenol, respectively. The safe concentrations of the juvenile prawn to BPA and phenol were 0.80 and 5.57 mg/L, respectively. TheLC50of 24 h and 48 h joint toxicity of BPA and phenol to the juvenile prawn were 0.97 and 0.51 TU, respectively. The TUi was less than 1, which meant that the joint action type is synergistic.

bisphenol A; phenol;Macrobrachiumnipponense; joint toxicity

2016-06-23；

2016-07-01

淮北师范大学生命科学学院资源植物生物学安徽省重点实验室资助项目(700851)

金显文，副教授，从事水生生态学教学与科研工作，E-mail: xianwenjin118@163.com

X171.5;Q958.116

A

2095-1736(2017)04-0038-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.038