卓莎+王莹+亢晓峰

摘 要 本研究利用合成的全-6-季铵基-β-环糊精（Per-6-quaternary ammonium-β-cyclodextrin，p-QABCD）装备基因工程化的α-溶血素（α-Hemolysin，αHL）蛋白质纳米孔（M113R）7，构建全新的单分子纳米孔反应器，在单分子水平实现对谷胱甘肽（GSH）和镉离子（Cd2+）的络合反应的实时原位监测，并辨认络合反应的不同路径、反应中间产物和最终产物。结果表明，溶液的pH值显著影响GSH与Cd2+络合产物的络合比例。pH=7.4时，GSH与Cd2+络合反应的最终产物为Cd（GSH）2； pH=9.0时，最终产物为Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2。其中，Cd2（GSH）2的形成遵循两种路径：（1）一个Cd2+首先结合两个GSH分子的巯基形成Cd（GSH）2，然后，第二个Cd2+结合去质子化的氨基形成Cd2（GSH）2； （2）两个Cd2+分别结合同一个GSH分子的巯基和去质子化的氨基形成Cd2（GSH）1，然后，第二个GSH分子的巯基和去质子化的氨基结合Cd2（GSH）1的Cd2+形成Cd2（GSH）2。本研究实现了在单分子水平无标记和无化学修饰研究金属离子和生物小分子的反应，对理解细胞内重金属的解毒机理和拓展纳米孔单分子技术的研究领域具有重要意义。

关键词 纳米通道； 单分子检测； 全-6-季铵基-β-环糊精； 谷胱甘肽； 镉离子

1 引 言

镉是人体的非必需元素，入侵人体会结合含巯基和氨基的蛋白质破坏肝和肾脏等器官中酶系统正常的生理功能，干扰细胞内的钙代谢引起成骨过程和正常骨代谢的紊乱，降低抗氧化酶的活性造成机体氧化损伤等[1，2]。谷胱甘肽（Glutathione， γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine， GSH）是细胞内普遍存在的含巯基三肽，具有独特的还原性和亲和性，易与入侵人体的Cd2+、Zn2+、Pb2+和Ni2+等重金属离子结合形成复合物并排出体外，是生物体内重要的重金属解毒物质[3～7]。因此，研究Cd2+与GSH的相互作用对探索生物体内重金属离子的生理功能和解毒机理具有重要意义。

GSH与金属离子络合反应的研究已有报道，主要集中于络合反应的作用位点和络合产物的结构及性质。常用的研究方法包括核磁共振法（NMR）[8，9]、 吸收光谱法[10]、电位滴定法[11]、荧光法[12]、循环伏安法（CV）[13，14]、红外光谱法[15，16]、示差脉冲极谱法（DPP）结合多变量曲线分析技术[17]等。GSH含有两个羧基（pKa1=2.12， pKa2=3.59 ）、一个氨基（pKa3=875）和一个巯基（pKa4=9.65），不同pH值下与金属离子的结合位点不同[18]，因此，络合反应过程的研究相对困难。发展一种直接、灵敏、实时监测络合反应过程的方法，尤其是在纳米空间内监测单分子水平的络合反应的方法，将为GSH与金属离子相互作用的研究提供新的平台。

以蛋白质纳米孔，如α-溶血素纳米孔，作为基础元件的纳米孔单分子检测技术在单分子分析、单分子化学反应研究和DNA测序等方面具有重要的研究和应用价值，研究对象包括金属离子、有机小分子和DNA等多种物质[19～23]。此技术是基于单个分子与纳米孔相互作用时纳米孔内离子电流的改变而建立的单分子分析技术[24～26]，已成功实现在单分子水平对化学反应的中间态以及反应路径的研究，包括二硫键的形成和断裂[24]，半胱氨酸与有机砷化合物共价键的形成和断裂[25]，砷与硫醇取代反应中七种产物的相互转化等[26]。但常需要在纳米孔中修饰反应物，容易受到分子构象的影响。本研究将合成的带正电的全-6-季铵基-β-环糊精分子适配器嵌入（M113R）7 αHL蛋白质纳米孔中，作为纳米反应器和传感器研究Cd2+与GSH的络合比例和反应中间产物，并成功区分不同络合比例的络合产物，揭示了Cd2+与GSH的反应路径。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Axopatch 200B膜片钳放大器和1440A A/D 数字转换器（美国Axon Instruments公司）； 4040A函数发生器（美国BK Precision公司）； UltiMate3000液相色谱-质谱联用电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪（美国Dionex公司）。

植烷酸卵磷脂（DPhPC，美国Avanti Polar Lipids公司）； 戊烷（99.7%，美国Honeywell Burdick & Jackson公司）； 聚四氟乙烯膜（Teflon膜， 英國Goodfollow公司）； 正十六烷（99%）、谷胱甘肽（≥98%）、碘甲烷（99%）、KCl（≥99.0%）、CdCl2（≥98%）、 KOH（≥85%）、甲酸（≥95%）、甲醛（≥36.0%）、二甲基甲酰胺（≥99%）、四氢呋喃（≥99.9%）和全-6-氨基-β-环糊精（Per-6-amino-β-cyclodextrin，98%），均购自美国Sigma-Aldrich公司。

2.2 全-6-季铵基-β-环糊精（Per-6-quaternary ammonium-β-cyclodextrin，p-QABCD）的合成[27]

取0.2360 g全-6-氨基-β-环糊精（Per-6-amino-β-cyclodextrin）与15.0 mL甲酸、8.0 mL甲醛和15.0 mL H2O混合，70℃下搅拌反应18 h。反应结束后，混合物真空干燥得到全-6-叔胺基-β-环糊精。将制备的全-6-叔胺基-β-环糊精和0.0150 g KOH悬浮在二甲基甲酰胺溶液中，添加300 μL碘甲烷，4℃，N2保护下反应4 h。将反应后的混合物减压浓缩到10.0 mL，添加60.0 mL四氢呋喃沉淀产物。四氢呋喃多次洗涤沉淀并真空干燥获得白色的p-QABCD固体。ESI-MS表征：[M]7+ m/z 208.4。

2.3 （M113R）7 αHL蛋白质纳米孔制备[28]

M113R αHL单体采用大肠杆菌BL21（DE3）pLysS原核表达制备，超滤离心纯化，并进一步在兔血红细胞膜上组装成（M113R）7 αHL七聚体。

2.4 实验方法[29]

中间有微米级小孔（直径120～150 μm）的Telfon膜将电解池分为两个腔室，用戊烷-正十六烷混合液（99∶1， V/V）预处理小孔使孔周围为疏水界面，电解池两端分别加入1 mL缓冲液（1 mol/L KCl， 10 mmol/L Tris-HCl， pH 7.4或pH 9.0）和一滴DPhPC，插入两根Ag/AgCl电极，静置5 min，加入0.5 mL缓冲液，使液面没过小孔，并在孔上形成磷脂双分子层。电解池一端加入终浓度为0.05～0.3 ng/mL的（M113R）7 αHL蛋白质（cis端，接地），另一端施加电压（trans端），待蛋白质扩散至小孔附近并插入脂双层形成单通道后，体系形成导通回路。膜片钳放大器采集电流信号，采样频率为100 kHz，滤波频率3 kHz。pClamp 10.3和Origin 8.5软件统计分析数据，平均滞留时间（τoff）、捕获频率（1/τon）经相应的事件数柱状图单指数拟合得到，平均阻塞电流值（I）经电流与事件数柱状图高斯拟合得到。

3 结果与讨论

3.1 分子适配器p-QABCD装备的（M113R）7 αHL纳米孔分别检测Cd2+和GSH （M113R）7αHL纳米孔是常用的突变型αHL纳米孔[30]，由7个113位的甲硫氨酸被精氨酸取代后的αHL单体聚合而成，腔内最窄处为7个精氨酸构成的正电荷环状结构，易于捕获带负电的分子或减小带负电分子的穿孔速度。Cd2+与GSH的络合物进入（M113R）7 αHL纳米孔，无电流响应信号。为了检测Cd2+-GSH络合物，将p-QABCD作为分子适配器嵌入（M113R）7 αHL纳米孔形成新型纳米反应器和传感器，即p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔（图 1A）。纳米孔的最窄处形成第二个正电荷的环状结构，通道内径明显缩小，静电作用位点增多，易于捕获Cd2+-GSH络合物。

检测电压为+160 mV时，（M113R）7αHL通道开放电流I0=（155.32 ± 5.11）pA（Level 0； 图1B）。 p-QABCD在电压驱动下从trans端嵌入纳米孔时，通道电流变为I1=（61.35 ± 4.12）pA（Level 1； 图1C）。将Cd2+加入trans端或将带负电的GSH加入cis端，无电流响应信号产生（图1D和1E）。结果表明， Cd2+或GSH单独进入p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔时不能引起电流的明显变化，推测原因是Cd2+和GSH的体积太小或穿过纳米孔的速度太快，现有的仪器分辨率不能捕获到明显的电流信号。

3.2 p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔监测Cd2+与GSH的反应进程

pH=9.0时，cis端加入GSH分子，trans端加入Cd2+，在正电压的驱动下， GSH和Cd2+进入纳米孔并在纳米孔或p-QABCD内部相遇（图 2A）发生络合反应，产生5种类型的电流信号，如图2B和2C中Ⅰ～Ⅴ所示，包含两种无过渡态的信号（Ⅰ和Ⅱ）和3种有过渡态的信号（Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）。推测无过渡态信号（Ⅰ和Ⅱ）是由Cd2+与GSH在纳米孔的大腔中相遇发生络合反应后形成的络合物被p-QABCD捕获产生； 有过渡态信号（Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）是由Cd2+与GSH分子直接在p-QABCD内部相遇并逐步发生络合反应产生，p-QABCD作为传感器记录络合反应过程。这5种信号集中在3个电流平台，分别为I2A = （42.52 ± 3.27） pA （Level 2A）； I2B = （34.21 ± 2.21） pA （Level 2B）； I2C = （24.52 ± 3.08） pA （Level 2C）； 相应的平均滞留时间τoff分别为τoff2A = （0.07 ± 0.01） ms； τoff2B = （0.26 ± 0.03） ms； τoff2C = （0.34 ± 0.04） ms（图2D～2G）。结果表明，pH=9.0时，Cd2+与GSH络合反应过程中会产生3种不同结构的络合中间产物或最终产物。

文献[9～17]表明，GSH的巯基与金属离子的结合几乎不受pH值的影响，而去质子化的氨基与金属离子的结合受pH值影响较大，在碱性条件下才会与金属发生络合反应。因此，为了确认3种络合中间产物或最终产物的结构，在pH=7.4和pH=9.0时，将不同浓度比的Cd2+与GSH同时加入cis端，使其在本体溶液中形成络合最终产物，记录络合最终产物进入p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔的电流响应信号。

3.3 p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔检测Cd2+-GSH 络合最终产物

3.3.1 pH=7.4时， p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔检测Cd2+-GSH络合最终产物pH=7.4时，将Cd2+和GSH同时加入cis端，二者在电解液中反应形成络合最终产物并进入p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔，只产生一种电流信号I2=（33.32±2.08） pA，τoff2 = （0.24±0.13） ms（Level 2； 图3A～3D），结果表明，pH=7.4时络合反应的产物只有1种。图3E表明，固定cis端GSH浓度为20 μmol/L， 随着Cd2+浓度增加，事件频率呈现先增大后稳定的趋势。当Cd2+与GSH浓度比<0.5时， Level 2事件频率呈线性增加，当浓度比>0.5时，Level 2事件频率趋于定值。结合文献[9，14，17]，Level 2由络合产物Cd（GSH）2产生。与GSH分子相比，Cd（GSH）2具有更大的分子结构并且在穿孔时有4个离子化的羧基与p-QABCD相互作用，易被捕获引起电流变化。Level 2的电流值和滞留时间与图2中Level 2B相似（I2B = （34.21 ± 2.21）pA； τoff2B = （0.26 ± 0.03） ms），表明Level 2B由络合产物Cd（GSH）2产生。

3.3.2 pH=9.0时，p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔检测Cd2+-GSH络合最终产物 pH=9.0时，同样将Cd2+和GSH同时加入cis端，共产生两种类型的电流信号： I3=（34.71 ±2.12） pA，τoff3 = （0.23±0.03） ms （Level 3） 和I4=（24.32±3.08） pA，τoff4 = （0.30±0.03） ms （Level 4）（图4A～4E），结果表明，pH=9.0时，Cd2+与GSH络合反应有两种产物。其中Level 3与图3中Cd（GSH）2的电流值和滞留时间接近（I2=（33.32±2.08）pA，τoff2 = （0.24±0.13） ms），表明Level 3是由络合产物Cd（GSH）2产生。图4F表明，固定cis端GSH浓度为20 μmol/L，随着Cd2+浓度增加，络合产物的相对比例发生明显改变。当Cd2+与GSH的浓度比低于0.5时，电流平台以Level 3为主，即络合产物Cd（GSH）2； 当浓度比在0.5～1.0之间时，Level 3的事件频率减小，Level 4的事件频率增大； 当浓度比>1时，Level 3和Level 4的事件频率趋于定值，以电流值较小的Level 4为主，表明产生Level 4的络合产物具有比Cd（GSH）2 （Level 3）更大的分子结构，结合文献[10，13，14]，表明Level 4是由络合产物Cd2（GSH）2产生。Level 4与图2中Level 2C的电流值和滞留时间相似（I2C = （24.52 ± 3.08） pA； τoff2C = （0.34 ± 0.04） ms），表明Level 2C是由络合产物Cd2（GSH）2产生的。

3.4 镉离子与谷胱甘肽的反应进程分析

上述实验表明，络合最终产物Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2的电流响应信号与监测络合反应进程中的Level 2B 和Level 2C的电流值与滞留时间相似， Level 2B和Level 2C的信号分别是由Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2产生。文献[9～17]表明，pH=9.0，GSH的巯基与去质子化的氨基均会与金属离子发生络合反应，但巯基与氨基很难络合同一种金属离子，因此推测Level 2A的信号由中间产物Cd（GSH）1或Cd2（GSH）1产生。典型的电流信号Ⅰ～Ⅴ表面，Cd2（GSH）2的形成遵循两种路径：（1）1个Cd2+首先结合2个谷胱甘肽分子的巯基，形成Cd（GSH）2，然后，第二个Cd2+结合去质子化的氨基形成Cd2（GSH）2（TypeⅠ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ； 图2D）； （2）2个Cd2+分别结合同一个GSH分子的巯基和去质子化的氨基，形成Cd2（GSH）1，然后，第二个GSH分子的巯基和去质子化的氨基与Cd2（GSH）1的Cd2+結合形成Cd2（GSH）2（TypeⅡ和Ⅴ； 图2D）。

3.5 p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔检测其它金属离子与GSH的络合反应

pH=9.0时，cis端加入GSH，trans端分别加入金属离子Pb2+、Zn2+和Ni2+。GSH与金属离子在纳米孔或p-QABCD中相遇并发生络合反应产生的典型电流信号如图5所示，均只产生两种类型的电流信号。GSH与Pb2+络合产物的电流平台集中在（21.27 ± 1.27） pA和（32.12 ± 1.04） pA，GSH与Zn2+络合产物的电流平台集中在（25.63 ± 2.02） pA和（36.35 ± 1.07） pA，GSH与Ni2+络合产物的电流平台集中在（26.73 ± 2.07） pA和（37.16 ± 1.12） pA，表明这3种金属离子与谷胱甘肽的络合产物为两种，但是均未产生有过渡态的电流信号，因此，p-QABCD-（M113R）7 αHL纳米孔不能观测到GSH与Pb2+、Zn2+或Ni2+络合反应的中间过程。上述实验结果表明，p-QABCD-（M113R）7αHL作为纳米反应器和传感器，能在单分子水平上特异性地检测Cd2+与GSH的反应中间产物并监测反应路径。

4 结 论

本研究采用分子适配器p-QABCD装备基因工程化的（M113R）7αHL蛋白质纳米孔，构建全新的单分子纳米反应器和传感器，实现在单分子水平对Cd2+与GSH的反应中间产物和最终产物的识别以及反应路径的特异性监测。研究结果表明，pH=7.4时，Cd2+与GSH的络合产物仅为Cd（GSH）2，pH=9.0时有两种络合产物，分别为Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2。通过分析Cd2+与GSH络合进程中的电流响应信号，揭示了Cd2（GSH）2的生成路径。本研究拓展了蛋白质纳米孔在单分子检测领域的应用，为实时监测单分子反应的反应进程和探索复杂反应的反应路径提供了新思路。

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