丁城，刘璐，胡勇*

(1.湖北工业发酵协同创新中心，武汉 430068；2.湖北省食品发酵工程技术研究中心 教育部发酵工程重点实验室，武汉 430068；3.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068)

基于神经网络模型预测辣椒提取液抗氧化性和亚硝酸盐清除率

丁城1,2,3，刘璐1,2,3，胡勇1,2,3*

(1.湖北工业发酵协同创新中心，武汉 430068；2.湖北省食品发酵工程技术研究中心 教育部发酵工程重点实验室，武汉 430068；3.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068)

辣椒包含丰富的活性物质并且对人体健康有益。本研究主要探究了辣椒提取液的抗氧化性和亚硝酸盐的清除作用。干红辣椒被浓度为1%～10%的乳酸、草酸、柠檬酸、乙酸和酒石酸连续提取。辣椒提取液中辣椒碱、辣椒红素、多酚和类黄酮物质被测定，以及抗氧化性和亚硝酸盐清除率被探究。在5种有机酸辣椒提取液中辣椒碱和辣椒红素含量分别为118.63～66.78 μg/g 和 26.67～7.37 μg/g，多酚和黄酮含量分别为357.03～182.53 mg/L和20.34～3.11 mg/L。草酸提取液的抗氧化性和亚硝酸盐的清除率最高。神经网络模型用于揭示活性成分与抗氧化性和亚硝酸盐清除率的关系，结果显示：辣椒红素和多酚物质与抗氧化性和亚硝酸盐清除率显著性最高。

活性物质；抗氧化性；亚硝酸盐；神经网络

亚硝酸盐可以改善肉制品的颜色，抑制食源性致病菌的生长，因此，被作为食品添加剂广泛地应用于食品中，亚硝酸盐在食品中最大添加量为156 mg/kg[1-3]。除此之外，亚硝酸盐还普遍存在于一些天然食物中，如蔬菜和腌制品。但是，亚硝酸盐能够和人体内胺类物质结合生成亚硝胺，这种物质会对人体造成很大伤害，例如致癌[4]。

分子氧是人体呼吸和产生三磷腺苷同时需要的物质，也是人类生存和生长不可缺少的物质[5]。然而，人体细胞蛋白的分解、脂肪的燃烧会产生过多的活性氧。过多的活性氧会对人体产生伤害，但是在一些天然食物中的活性物质能够消除活性氧，减少对人体的危害[6-8]。

红辣椒属于茄科植物，包含大量活性物质，如辣椒碱[9]、辣椒红素[10]、维生素C[11]、多酚和黄酮[12]等物质，这些物质都具有一定抗氧化性。辣椒中辣椒碱和辣椒红素具有抗癌的作用[13]，此外，辣椒含有许多抗氧化物质，如多酚、黄酮、辣椒红素、抗坏血酸[14-17]。然而，一些抗氧性物质和亚硝酸盐清除有着密切的联系[18]。

神经网络模型是处理大量信息的有效工具，在许多领域被广泛利用，同时在食品工业中应用不断增加[19]。2010年，Dwivedi和 Ramaswamy[20]建立了罐头传热神经网络模型；1995年，Sablani等[21]建立了神经网络模型对罐头食品最佳优化条件的预测。2002年，Mittal和Zhang[22]报道了神经网络模型预测升温对灭菌的影响。

在本研究中，辣椒被不同有机酸提取，提取液的抗氧化性和亚硝酸盐清除率被探究。通过提取液中活性成分和抗氧化性、亚硝酸盐清除率，神经网络模型被建立。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

辣椒碱、辣椒红素、甲醇、二氯甲烷、DPPH、亚硝酸钠等试剂。

红辣椒：采购于永州农业综合开发有限公司。

1.2 辣椒提取液的制备

辣椒被粉碎机粉碎后，准确称取5 g辣椒粉置于250 mL容量瓶中。分别用浓度为1%～10%的草酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸和乙酸与辣椒粉充分混匀，然后置于50 ℃恒温水浴锅中1 h，再超声0.5 h，过滤备用。

1.3 多酚的测定

总酚类物质采用Folin-Ciocalteu法测定。将100 μL的提取液放置于试管中，并用水调至10 mL，然后加入0.5 mL的福林酚试剂，反应1 min后，添加1.5 mL的20%饱和碳酸钠，充分混匀，反应1 h后，在波长765 nm处，用紫外可见分光光度计测定。总酚被表示为等价没食子酸。

1.4 黄酮类物质测定

0.5 mL的红辣椒提取物与4.5 mL的15%乙醇混合，然后加入0.3 mL的0.5 mol/L亚硝酸钠溶液和0.3 mL的0.3 mol/L氯化铝溶液。混合后反应5 min，然后加入2 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液和10 mL的15%乙醇，反应10 min。在506 nm处，用紫外可见分光光度计测定。总黄酮类化合物被表示为等价儿茶素。

1.5 辣椒碱和辣椒红素的测定

辣椒碱和辣椒红素用高效液相色谱法测定。

1.6 亚硝酸盐清除率的测定

准确吸取2 mL亚硝酸钠溶液(6 μg/mL)，置于50 mL容量瓶中，然后加入10 mL的辣椒提取液摇匀，放置30 min，加入2 mL对氨基苯磺酸，摇匀后，避光反应3 min，再加入1 mL的盐酸萘乙二胺，摇匀，避光反应15 min，然后定容至刻度线，在538 nm处测定吸光值，同时做空白对照。

式中：A1为未加入辣椒提取液测定的吸光值，A2为加入辣椒提取液测定的吸光值。

1.7 抗氧化性的测定

1.7.1 DPPH自由基清除率的测定

0.1 mL的红辣椒提取物添加到3.9 mL的0.06 mmol/L DPPH甲醇溶液中，充分混匀。然后在黑暗中反应20 min，在515 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率计算公式如下：

DPPH自由基清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100。

式中：Ai为未加入辣椒提取液测定的吸光值，Aj为加入辣椒提取液测定的吸光值。

1.7.2 羟自由基清除率的测定

红辣椒提取液添加到96孔板中，然后加入0.1 mL3 mmol/mL 1,10-邻菲罗啉和0.1 mL 3 mmol/mL FeSO4，再加入0.1 mL的0.01%过氧化氢溶液，充分混匀，在37 ℃反应1 h，在536 nm处测定吸光度。羟自由基清除率计算公式如下:

式中：A1为未加入辣椒提取液测定的吸光值，A2为加入辣椒提取液测定的吸光值，A0为空白吸光值。

1.7.3 超氧阴离子基清除率的测定

将80 μL焦棓酸和4.5 mL Tris-HCl-EDTA缓冲液加入样品中。混匀后，在室温下反应30 min，在365 nm处测定吸光度。超氧阴离子基清除率计算公式如下：

式中：A1为加入辣椒提取液测定的吸光值，A2为加入辣椒提取液但未加入焦棓酸测定的吸光值，A0为未加入辣椒提取液测定的吸光值。

2 结果与分析

2.1 辣椒碱和辣椒红素的含量

不同浓度的5种有机酸提取液中，辣椒碱和辣椒红素的含量具有差异。乳酸、乙酸、酒石酸、柠檬酸和草酸提取液中辣椒碱和辣椒红素含量见表1。

表1 多酚、黄酮、辣椒碱和辣椒红素含量Table 1 Total phenolics, flavonoids, capsaicin and capsorubin content of organic acid extract of red pepper

注：a 等价于没食子酸；b 等价于儿茶素。

辣椒碱和辣椒红素的含量在不同提取液中，含量变化分别为：118.63～66.78 μg/g和26.67～7.37 μg/g。2%的草酸提取液中，辣椒碱的含量最高(118.63 μg/g)，而3%的草酸提取液中，辣椒红素的含量最高(26.67 μg/g)。然而，最低含量的辣椒碱(66.78 μg/g)和辣椒红素(7.37 μg/g)分别在2%(V/V)乙酸和1%(W/V)柠檬酸中被发现。辣椒红素是一种重要的天然类胡萝卜素，Daood等[23]研究：类胡萝卜素是一类亲脂性物质，除此之外，在高温下，类胡萝卜素会大量地减少，这也许可以解释提取液中辣椒红素含量较少的原因。

2.2 总酚类物质和类黄酮

多酚类化合物和黄酮类化合物，如芸香苷、儿茶素和柚苷配基，普遍存在于植物中，而这些化合物具有重要的生理活性[24]。5种有机酸提取液中总酚类物质和类黄酮含量见表1。酚类物质和类黄酮含量变化分别为357.03～182.53 mg/L的没食子酸，20.34～3.11 mg/L的儿茶素。6%(V/V)乳酸提取中液总酚类物质含量最高，5%(V/V)乳酸提取液中类黄酮物质含量最高。

2.3 不同提取物对亚硝酸盐清除率的影响

亚硝酸盐是潜在的致癌物质，亚硝酸盐的过度消费会增加患癌症的风险[25]。为了研究不同提取液对亚硝酸盐清除率的作用，对不同浓度的有机酸提取液进行了亚硝酸盐清除率测试，结果见表2。有机酸提取液对亚硝酸盐的清除率和有机酸的种类和浓度有关，更具体地说，随着酸的浓度增加，亚硝酸盐清除率先增加然后减少，这可能是随着酸的浓度增加，活性成分的减少，而导致亚硝酸盐清除率的下降。4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%柠檬酸和2%草酸提取液中亚硝酸盐清除率最高，分别为96.8%，96.3%，95.4%，93.6%，98.3%。Kang报道具有抗氧化性的活性物质和亚硝酸盐的清除率有着紧密的关系。辣椒含有多酚类物质、辣椒红素、维生素C、维生素E和生物碱，这可能是辣椒提取液具有较强的亚硝酸盐清除能力的原因。

表2 提取液抗氧化性Table 2 DPPH radical, hydroxyl radical, superoxide radical and nitrite scavenging activity of organic acid extract of red pepper %

此外，进一步探究了4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%柠檬酸和2%草酸提取液不同添加量和反应时间对亚硝酸盐清除率的影响，结果见图1。

图1 辣椒提取液浓度和反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

亚硝酸盐清除率先不断上升最后趋于平稳，不同有机酸对亚硝酸盐清除率作用依次为草酸>乳酸=乙酸>酒石酸>柠檬酸。

2%草酸提取液亚硝酸盐清除率最高，在反应时间为5～35 min时，亚硝酸盐清除率变化范围为95.6%～98.9%。然而，在15 min时，亚硝酸盐清除率趋于平稳。有趣的是，我们发现4%乳酸提取液亚硝酸盐清除率和6%乙酸提取液大致相同。

2.4 抗氧化活性

不同浓度的有机酸提取液DPPH自由基清除率、超氧阴离子基清除率和羟自由基清除率见表2。DPPH自由基清除率变化范围为41.1%～74.3%。2%草酸、6%乳酸、5%酒石酸、5%乙酸和3%柠檬酸提取液DPPH自由基清除率最高，依次为74.3%，74.2%，62.5%，73.9%，54.3%。羟基自由基清除率和超氧阴离子基清除率变化范围分别为60.1%～21.4%和59.4%～23.9%。

进一步研究了不同浓度的4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%柠檬酸和2%草酸红辣椒提取液抗氧化性，结果见图2。

图2 辣椒提取液抗氧化性

提取液浓度很低时，5种提取液抗氧化性没有差别。然而，抗氧化性随着提取液的浓度增加而上升，在4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%柠檬酸和2%草酸红辣椒提取液中，2%草酸提取液抗氧化性最强。6%乙酸和4%酒石酸提取液羟自由基清除率大致相同。总的来说，4%乳酸、6%乙酸、4%酒石酸、3%柠檬酸和2%草酸提取液自由基清除率和生物活性物质含量成正比(见表1)。此外，提取液中含有维生素C，但是在本研究中并没有测定。这些结果表明：提取液中生物活性物质含量与有机酸的种类和浓度有关，也与自由基清除率有着密切的联系。通过提取液中的生物活性物质，可以确定抗氧化活性的强弱[26]。因此，提取液中的活性成分与抗氧化性和亚硝酸盐清除率有着怎样的联系值得被研究。

2.5 神经网络模型的建立

人工神经网络包含3个层，即输入层、输出层和隐藏层。在这项研究中，多酚类物质、总类黄酮、辣椒碱和辣椒红素构建神经网络的输入神经元，DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子基清除率和亚硝酸盐清除率构建神经网络的输出神经元。隐含层神经元变化范围为3～21。所有的数据被随机分为3组：训练(50%)、交叉(20%)和验证(30%)。

2.5.1 敏感性分析

人工神经网络模型敏感性分析是通过处理不同的输入层，不断优化模型，而确定重要因素的一种有效的工具，这个过程可以在整个神经网络中选择贡献最大的因素。如果灵敏度因子越大表明该因素与抗氧化活性、亚硝酸盐清除率显著性较高，相反，则显著性较低。神经网络中每个因素的敏感性见图3。

图3 神经网络敏感性分析

与其他的输入神经元比较，多酚类物质和辣椒红素与抗氧化性和亚硝酸盐清除率显著性较高，其次是总黄酮类物质。我们发现亚硝酸盐清除率与辣椒碱显著相关，但是与抗氧化性无显著性。

2.5.2 人工神经网络建模的性能

在这项研究中，人工神经网络模型是一个3层反向传播网络，包含4个输入神经元和4个输出神经元。ANN模型的测试性能见表3。

表3 神经网络模型参数Table 3 Parameters of GA-ANN model

在模型中，标准误差小于1，而亚硝酸盐清除率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和超氧阴离子基清除率相关系数分别为0.964，0.956，0.967，0.964，说明对抗氧化性和亚硝酸盐清除率、神经网络具有良好的拟合性。神经网络预测值和实际值见表4。

表4 活性物质与亚硝酸盐清除率和抗氧化性关系Table 4 The relationship between active ingredients and nitrite scavenging activity and antioxidant activity

在网络训练过程中，神经网络展现了良好的性能，并且能够根据提取液中活性成分准确预测抗氧化活性和亚硝酸盐清除率。残差分析是验证模型的输出层，结果能有效地验证模型是否可以被接受。抗氧化性和亚硝酸盐清除率的残差值分析见图4。

图4 残差值与预测值

注：(A)为亚硝酸盐，(B)为DPPH，(C)为羟基，(D)为超氧化物。

残差值随机分布在水平线两边，残差值可以有效地评估模型预测的性能。如果残差值随机分布，说明模型有着良好的预测性能，否则，模型预测性能较差。由图4可知，该模型能够有效地预测和拟合数据。

3 结论

在本实验中，辣椒提取液中活性成分被测定，并探究了提取液的抗氧化性(DPPH自由基清除率、超氧阴离子基清除率和羟自由基清除率)和亚硝酸盐清除率。辣椒提取液中活性成分含量(辣椒碱、辣椒红素、多酚类物质和黄酮类物质)的不同，导致了提取液有着不同的抗氧化性和亚硝酸盐清除率。2%草酸提取液抗氧化性和亚硝酸盐清除率最高。辣椒提取液有着良好的抗氧化性和亚硝酸盐清除率，这与提取液中辣椒红素和多酚类物质有着重要的联系。

通过人工神经网络，将辣椒提取液中活性成分与抗氧化性和亚硝酸盐清除率建立联系，结果显示：神经网络有着良好的拟合和预测性能。该模型可以作为辣椒提取液实验设计和优化的一个有效工具。根据实验结果，有机酸提取液可以改善食品安全，提高食品质量。辣椒提取液中一些特定的活性物质与潜在的健康和食品质量之间的关系需要进一步研究。

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Prediction of Antioxidant Activity of Pepper Extract and Clearance Rate of Nitrite Based on Neural Network Model

DING Cheng1,2,3, LIU Lu1,2,3, HU Yong1,2,3*

(1.Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Wuhan 430068, China;2.Key Lab of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei Province,Wuhan 430068, China;3.College of Bioengineering and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Pepper contains rich active ingredients and physiological active substances promoting the health. Investigate the effects of pepper extract on antioxidant activity and scavenging activity of nitrite. Red peppers are extracted using different concentration (1%～10%) of solvent such as lactic acid, oxalic acid, citric acid, acetic acid and tartaric acid.The levels of specific bioactive compounds (capsaicin, capsorubin, polyphenols and flavonoids substances) are determined, and the antioxidant activity and nitrite scavenging activity are investigated. The capsaicin and capsorubin are extracted from the five organic acids, ranging from 118.63 μg/g to 66.78 μg/g and 26.67 μg/g to 7.37 μg/g respectively. The polyphenols and flavonoids content varies from 357.03 mg/L to 182.53 mg/L and 20.34 mg/L to 3.11 mg/L respectively. The antioxidant activity and nitrite scavenging ability are the highest in oxalic acid extract. The developed ANNs are able to reveal the relationship between the active ingredients and antioxidant activity and nitrite scavenging activity. The antioxidant activity and nitrite scavenging activity are significantly correlated with capsorubin and phenolics.

active ingredients; antioxidant activity; nitrite; neural network

2017-01-22 *通讯作者

丁城(1991-)，男，湖北武汉人，硕士，研究方向：食品发酵与分子生物学； 胡勇(1980-)，男，湖北荆门人，讲师，博士，研究方向：醋酸菌等工业微生物遗传学、基因组学和代谢组学特征。

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.018

1000-9973(2017)07-0082-08