刘 念，李玉红，2，郑恩金,高大庆，陆承平



基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

刘 念1，李玉红1，2，郑恩金1,高大庆1，陆承平3

目的 Eha是一个影响迟缓爱德华菌(Et)胞内生存的转录调控因子,本研究有助于揭示其调控Et抵御酸的分子机制。方法 用ATPase 抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化，菌落计数法比较酸化对野生株和eha基因缺失株胞内存活数目的影响；比较两种细菌在酸性应激实验中存活率的差异;构建pMP220-PehaLacZ质粒，采用β-半乳糖苷酶实验检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性；选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR验证其结果。结果 野生株ET13在巨噬细胞内和不同pH酸环境中的存活率明显高于缺失株，阻止酸化胞内菌数明显高于未阻止酸化的胞内菌数(P<0.05)。对数期细菌pH6.3培养基生长2 h，RNA-Sequencing结果表明：eha基因缺失株转录水平和野生株相比，147个差异显著表达的基因(DEGs)(|log2 Ratio|≥1)，其中113个上调，34个基因下调，qRT-PCR随机抽样，和RNA-Sequencing 表达趋势呈强相关。147个基因采用GO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份；基于KEGG通路的富集分析,有130个可以富集到55条通路中，包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径，涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。结论 在酸性生存环境，Eha对Et的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控。

eha基因；RNA-sequencing；E.tarda；酸化

迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda，简称Et)属于肠杆菌科爱德华菌属，该菌能够感染多种鱼类，是水产养殖业的重要病原体[1]。Et也可感染人，引起人的胃肠炎、腹膜炎、败血症和脑膜炎等疾病[2]。Et溶血调控基因(Et haemolysin activator gene，简称eha)是Et一个重要的毒力调控基因[3-4]，Et菌能够抵抗巨噬细胞吞噬体内氧化和酸化的杀菌而生存繁殖，是其致病的关键[5]，eha基因缺失引起Et 在巨噬细胞内繁殖率降低的机制[6],尚未完全研究清楚。高通量测序技术，具有测序通量高、成本低、速度快等特点，广泛应用于动植物及微生物的基因组学、转录组学等领域的研究。

近年来，随着新一代高通量测序技术(High-throughput sequencing technology)的发展，转录组测序(RNA sequencing，RNA-Seq)技术已成为测序技术的重要手段。……