赵旭

他克莫司对难治性重症肌无力患者疗效以及调节性T细胞的影响

赵旭

目的 观察他克莫司对难治性全身型重症肌无力的临床疗效、安全性以及治疗前后调节性T细胞比例变化。方法 选取2013-09—2015-05于辽宁省海城市中心医院由他克莫司治疗的难治性全身型重症肌无力患者23例，采用3 mg/d的他克莫司口服治疗，观察记录治疗前以及治疗后6个月每个月的MGFA以及MG-ADL评分，并检测治疗前和治疗后6个月外周血中CD4+CD25+调节性T细胞比例以及Foxp3的表达水平。结果 患者MGFA以及MG-ADL评分等临床疗效指标接受他克莫司治疗后显著下降，并且随着治疗时间的延长，改善的效果越好。不良反应的发生率为43.5%(10/23)，主要表现为血糖的升高、肾结石、感染、头痛头晕、听力下降和腹泻。他克莫司治疗可以显著提高外周血CD4+CD25+调节性T细胞比例以及Foxp3的表达水平。结论 他克莫司对于难治性全身型重症肌无力的临床治疗具有一定的疗效，并且可能是通过增加调节性T细胞的比例的机制来发挥作用。

他克莫司；难治性重症肌无力；MGFA；MG-ADL；调节性T细胞

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种发生在神经肌肉接头处由AChR抗体介导的自身免疫性疾病[1]。目前主要的治疗方法有糖皮质激素、胸腺切除术、免疫抑制剂、血浆置换以及免疫球蛋白等[2-3]，但是仍存在部分患者对上述常规治疗方法无应答或者疗效不佳，这部分患者被称为难治性重症肌无力(intractable myasthenia gravis)[4]。

他克莫司(tacrolimus)，又名FK506，作为免疫抑制剂的一种，目前在国外被报道应用于难治性重症肌无力[5-7]，但目前国内报道的例数较少。本文通过对我科2013-09—2015-05应用他克莫司治疗的难治性全身型重症肌无力的疗效和安全性进行评估，并通过检测治疗前后外周血调节性T细胞的变化以及转录因子Foxp3的表达对其进行初步机制的探讨。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 选取2013-09—2015-05于我院神经内科就诊的23例确诊为难治性全身型重症肌无力患者，其中男6例，女17例；平均年龄(42.1±8.3)岁；所有患者均签订知情同意书。纳入标准主要参照Drachman等[8]难治性重症肌无力的界定标准：①年龄18岁以上。②临床上确诊为重症肌无力患者。③接受过以往常规治疗(胸腺切除、免疫抑制剂以及糖皮质)并满足以下条件之一：治疗效果不佳且患者的工作生活受到明显的影响；依赖于大剂量的糖皮质激素治疗并且伴有严重的不良反应者；对糖皮质激素治疗不耐受者。排除标准：①明显肝肾功能不全者。②严重感染(如HIV感染)、恶性肿瘤者。③对他克莫司药物过敏。④哺乳或妊娠期以及神经疾病患者。⑤参与其他临床对照治疗实验。

1.2 治疗方案 他克莫司均来源于中国安斯泰来制药有限公司，剂量参考Tada等人之前的研究[9]，所有纳入患者在保持原有治疗方案的基础上，口服3 mg/d他克莫司，早上1 mg，晚上2 mg，且均为饭后至少2 h后服用。所有的患者在治疗前以及治疗后前半年每个月进行美国MG基金会分型评定(Myasthenia Gravis Foundation of America，MGFA)和MG日常生活量表评分(the myasthenia gravis activities of daily living scale，MG-ADL)[10-11]。

1.3 流式细胞术检测调节性T细胞亚群 空腹采集纳入治疗的患者静脉血2 mL于EDTA抗凝管中，加入等体积的Hank's缓冲液稀释后缓慢加到人外周血淋巴细胞分离液上层，1 000 g离心20 min之后，将中间的白膜样淋巴细胞吸出来，将得到的人外周血单个核细胞分别用购自BD公司的CD3+，CD25+，CD4+流式抗体标记，室温20 min后，根据e-Bioscience公司购买的穿膜打孔试剂盒的操作说明书进行固定，穿膜打孔后，取Foxp3抗体室温避光孵育1 h，加入Hank's缓冲液洗一遍后重悬细胞，上机检测，并用Flowjo软件对所得的各个细胞亚群的比例和表达进行分析。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0软件对所有的变量数据结果进行分析操作，结果用(±s)表示，如果所得数据呈正态分布，采用配对t检验进行比较，如果数据的分布不符合正态分布，则采用配对Wilcoxon秩和检验进行比较不同时间点评分变化。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 研究结果

2.1 他克莫司治疗难治性重症肌无力的疗效观察 所有23例接受治疗的患者都完成了整个治疗过程，中途无因不良反应而停药的患者。他克莫司治疗难治性全身重症肌无力的MGFA以及MG-ADL评分(表1)，与治疗前相比，治疗后1～6个月的时间点，MGFA和MG-ADL的评分随着治疗时间的延长而逐渐下降，并且各个时间点之间差异具有高度统计学意义(P＜0.001)。

表1 他克莫司治疗各个随访时间点的疗效指标的变化(±s)

表1 他克莫司治疗各个随访时间点的疗效指标的变化(±s)

治疗时间 n MGFA P值 MG-ADL P值1个月 23－2.33±3.51＜0.001－2.42±2.45＜0.001 2个月 23－3.68±3.71＜0.001－3.56±2.36＜0.001 3个月 23－3.90±4.03＜0.001－3.89±3.42＜0.001 4个月 23－4.32±3.95＜0.001－4.45±3.75＜0.001 5个月 23－4.67±3.83＜0.001－4.60±3.92＜0.001 6个月 23－5.54±4.65＜0.001－4.87±4.25＜0.001

2.2 他克莫司治疗难治性重症肌无力的不良反应 随访6个月的时间内，有10例患者出现不同程度的药物不良反应，其中有4例在服药的第4个月出现空腹血糖的升高，3例出现肾结石和轻微的感染，其他3例分别出现不同程度的头痛头晕、听力下降和腹泻。不良反应的发生率为43.5%(10/23)。

2.3 他克莫司治疗难治性重症肌无力的调节性T细胞比例以及Foxp3表达的变化 他克莫司治疗难治性重症肌无力前后外周血CD4+CD25+调节性T细胞占总CD4+T细胞比例以及Foxp3在CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平(表2)，治疗6个月后，外周血CD4+CD25+调节性T细胞较治疗前显著增加 (P＜0.05)，Foxp3在CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平显著增加(P＜0.01)。

表2 他克莫司治疗难治性重症肌无力前后调节性T细胞比例及Foxp3表达(±s)

表2 他克莫司治疗难治性重症肌无力前后调节性T细胞比例及Foxp3表达(±s)

组别 治疗前 治疗后6个月 P值CD4+CD25+/CD4+ 6.52±1.85 8.83±1.42 ＜0.05 Foxp3+/CD4+CD25+ 0.91±0.24 1.23±0.16 ＜0.01

3 讨论

他克莫司作为一种免疫抑制剂，目前广泛用于一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性肝病等的研究[12-13]。自20世纪90年代起，他克莫司被用于重症肌无力的治疗，Minami等[14]报道了利用2～3 mg/d的他克莫司治疗全身型重症肌无力的9例患者，并随访5年发现可以明显增强MG-ADL，并可以将糖皮质激素的治疗从24 mg/d减至10.2 mg/d。Nagaishi等[15]用3 mg/d的他克莫司联合糖皮质激素治疗10例重症肌无力患者，发现7例症状得到明显的改善，并且副作用较低。在本文的研究中，我们采用了3 mg/d的他克莫司治疗23例难治性全身型重症肌无力患者，同时采用了MGFA以及MG-ADL反映临床的疗效。其中MGFA主要反映的是重症肌无力患者的疲劳耐受性，而MG-ADL主要反映重症肌无力患者日常生活状态，我们研究发现，在他克莫司治疗1个月后，患者的日常生活就得到了明显的改善，并且随着治疗的时间延长，改善一直在逐步持续。在纳入的23例患者中，其中存在16例联合泼尼松治疗的患者，发现加入他克莫司进行联合治疗后，其中13例患者泼尼松的使用剂量显著减少，3例患者由于减少了泼尼松的使用剂量导致治疗效果不佳，最后重新恢复原有的剂量。我们的研究与之前国外报道的结果相一致，说明他克莫司对于难治性重症肌无力的临床症状改善具有较好的疗效。

重症肌无力患者中调节性T细胞数量下降以及自身反应性T细胞的大量增殖和激活是其发病的机制之一[16]。糖皮质激素的治疗可以显著地提高调节性T细胞转录因子Foxp3 mRNA的表达水平，暗示着糖皮质激素可能是通过促进外周调节性T细胞数量的增加减弱重症肌无力患者体内自身免疫性反应[17]。有研究发现他克莫司可以通过上调调节性T细胞的比例来治疗寻常型银屑病[18]。在本研究中发现，他克莫司治疗6个月后，外周血无论是CD4+CD25+调节性T细胞比例还是转录因子Foxp3的表达水平均显著上调，暗示着他克莫司可能也是通过上调调节性T细胞比例和活性降低自身反应性T细胞的增殖和激活。

综上所述，他克莫司对于临床难治性全身型重症肌无力患者在临床上具有一定的疗效，副作用较小，并且他克莫司可能是通过增加调节性T细胞的比例和数量降低重症肌无力的外周自身免疫性反应，但是本研究中样本数量有限，仍然需要扩大样本进行进一步研究。

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Objective To explore the clinical effects and safety of Tacrolimus in the treatment of refractory systemic type myasthenia gravis and observe the changes of regulatory T cells proportion before and after treatment.Methods 23 patients who were diagnosed with refractory systemic type myasthenia gravis and treated with Tacrolimus at Haicheng Central Hospital，Liaoning Province from September 2013 to May 2015 were selected and given oral Tacrolimus for 3mg/d.Scores of MGFA and MG-ADL were measured before treatment and monthly during the first 6 months after treatment.Meanwhile the expression levels of CD4+CD25+regulatory T cells proportion and Foxp3 in peripheral blood before treatment and during the 6 months after treatment were analyzed.Results The clinical effect indexes of MGFA and MG-ADL were significantly decreased after treatment of Tacrolimus，and with time going，the improvement effects got better.The incidence rate of adverse reaction was 43.5%(10/23)，mainly including blood glucose rise，kidney stone，infection，headache and dizziness，hearing loss and diarrhea.Tacrolimus can significantly increase the expression levels of CD4+CD25+regulatory T cells proportion and Foxp3 in peripheral blood.Conclusion Tacrolimus shows certain curative effects in the clinical treatment of refractory systemic type myasthenia gravis，which is likely to exert the function by means of increasing the regulatory T cells proportion.

Tacorlimus；Refractory myasthenia gravis；MGFA；MG-ADL；Regulatory T cells

2016-12-09)

1005-619X(2017)05-0472-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.05.009

114200 辽宁省海城市中心医院