谭韡++于红刚++罗和生++周巍

[摘要] 目的 探讨慢病毒载体靶向携带Akt1基因短发夹RNA（Akt1-shRNA）对胃癌细胞SGC-7901凋亡和增殖的影响。 方法 构建表达Akt1-shRNA的慢病毒载体，转染293T细胞后获得Akt1-shRNA的慢病毒颗粒，病毒感染胃癌SGC-7901细胞（SGC-LV-shAkt1）为实验组细胞，SGC7901细胞和转染慢病毒空载体SGC7901细胞（SGC-LV-shCON）为对照组细胞。Real-Time PCR检测Akt1 mRNA表达水平，Western blot检测胃癌细胞Akt1、phospho-Akt（ser473）和bcl-2蛋白表达水平，然后流式双染法、生长速率等方法检测Akt1 shRNA对SGC-7901细胞凋亡及增殖能力的影响。 结果 成功构建Akt1基因RNAi的慢病毒载体LV-shAkt1，病毒滴度为5×108 TU/mL。SGC-7901细胞转染后，实验组（SGC-LV-shAkt1）Akt1 mRNA 和Akt1、p-Akt、bcl-2蛋白表达水平较对照组（SGC-7901、SGC-LV-shCON）降低（P < 0.01）；（38.7±3.5）%的实验组细胞凋亡（P < 0.05）。SGC-LV-shAkt1细胞生长曲线平缓，生长速度较另两种细胞（SGC-7901、SGC- LV-shCON）明显降低。 结论 靶向Akt1的RNAi 能有效抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，诱导胃癌细胞凋亡，其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路，下调抗凋亡蛋白bcl-2有关。

[关键词] Akt1；慢病毒载体；胃癌；凋亡

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（b）-0023-05

Department of Gastroenterology， Renmin Hospital of Wuhan University Hubei Key Laboratory of Digestive System Disease， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis and proliferation effect of lentiviral vectors shRNA for Akt1 to human gastric carcinoma SGC-7901 cells. Methods The lentiviral vectors Akt1-shRNA were constructed， lentivirus Akt1-shRNA was transfected into human gastric carcinoma SGC-7901 cells， the SGC-7901 cell strained with Akt1 gene silencing perpetually （SGC-LV-shCON） was as conrol group cell and amplified （SGC LV-shAkt1） was as experiment group cell. Effect of Akt1 on SGC-7901 cells were measured by RT-PCR， Western-blot， flow cytometry of annexin V-FITC/PI， tumor growth curve. Results Akt1 RNAi lentiviral vectors LV-shAkt1 was established successfully， virus titer was 5×108 TU/mL. After SGC-7901 cell transfection， the expression of Akt1 mRNA in experiment group （SGC- LV-shAkt1） was weaker than that in the control group （SGC-7901， SGC- LV-shCON）， and Akt1， p-Akt and bcl-2 protein expressions in experiment group was inhabited （P < 0.01）， （38.7±3.5）% cell in experiment group happened apotosis （P < 0.05）. The cell growth curve of SGC-LV-shAkt1 cell was gentle， compared with SGC-7901 cell or SGC- LV-shCON cell， the growth was lower. Conclusion The lentiviral vectors mediated shRNA for Akt1 can significantly inhibit the expression of Akt1 gene in vitro and markedly inhibit SGC-7901 cell growth and induce the apoptosis of gastric carcinoma cell.The mechanism may be down-regulation of PI3K/Akt signal pathway and anti-apoptosis protein bcl-2 expression.

[Key words] Akt1； Lentiviral vector； Gastric carcinoma； Apotosis

Akt，又稱蛋白激酶B （protein kinase B，PKB） ，是1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。目前发现至少存在3种Akt家族成员：Aktl/PKBα、Akt2/PKBβ、Akt3/PKBγ[1]。许多文献报道，Akt与肿瘤的发生、发展关系密切[2-3]。慢病毒载体靶向介导的RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种高效的基因沉默技术，能特异性阻断哺乳动物细胞中靶基因的表达[4]。本研究通过构建Akt1靶向短发夹RNA（shRNA）真核表达载体，阻断胃癌细胞Akt1的表达，观察转染后胃癌细胞增殖和凋亡的变化，为其在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞SGC-7901购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。转染试剂Lipofectamine 2000，Trizol试剂和兔抗人Akt1、phospho-Akt（ser473）购自Invitrogen公司。鼠抗人bcl-2抗体购自Sigma公司、actin抗体和ECL发光剂购自美国Santa Cruz公司。RT-PCR试剂盒来自TOYOBO公司，引物由上海Invitrogen公司设计合成。Annexin V-FITC/PI双染试剂盒及磷酸化蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

慢病毒载体系统：慢病毒载体系统由……