高山山+郭慧清+张泽坤+白光灿+高晓燕+马长华

[摘要] 为揭示炎症细胞模型的极性代谢组特征，该文选择RAW264.7细胞为研究载体，以LPS刺激诱导炎症细胞模型，进行细胞代谢组学的指纹分析。具体方法为：筛选、优化了细胞内极性代谢物的提取方法，建立了利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）进行细胞内代谢组的数据采集方法，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行数据处理，筛选并初步鉴定了17种差异代谢物。结果显示，采用MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）作为提取溶剂，色谱峰数目较多，细胞内极性代谢物提取效率较高，分析方法的稳定性较好；与正常细胞相比，炎症细胞的蛋白质代谢、糖代谢、核苷酸代谢等代谢通路受到扰动。该研究建立了基于UPLC-Q-TOF/MS的RAW264.7细胞代谢组学指纹分析方法，为揭示细胞炎症机制及抗炎药物机制研究奠定基础。

[关键词] 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱； 代谢指纹分析； 代谢组学； 炎症细胞； 正交偏最小二乘判别分析

[Abstract] In order to reveal the properties of polar metabolome in inflammatory cells， we selected LPS-induced RAW264.7 inflammatory cell models as the carrier for the research of metabolic fingerprint analysis. In this study， an ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS）-based metabolomics protocol was optimized for the extraction of polar metabolites from RAW264.7 cell line. Then orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） was used to process the metabolic data， and finally， a total of 17 metabolites were selected and identified. The results showed that MeOH-CHCl₃-H₂O （8∶1∶1） was chosen as the optimal extraction solvent to achieve higher number of chromatographic peaks， with the best relative extraction efficiency and stability. Comparing with the normal cells， the inflammatory cells presented an abnormal metabolism in protein， carbohydrate， nucleotide and phospholipids. In this study， a UPLC-Q-TOF/MS-based metabolomics protocol for the polar metabolites from RAW264.7 cell line was developed， which may provide important information for the study of mechanism of inflammation and the anti-inflammatory drugs.

[Key words] ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF/MS）； metabolic fingerprint analysis； metabolomics； inflammatory cells； orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）

細胞代谢组学是系统生物学的重要组成部分[1]，分为代谢指纹分析和代谢足迹分析，其研究对象分别为胞内代谢组与胞外代谢组，两者具有高度的信息互补性[2]。胞内代谢组是细胞内复杂生化活动状态的综合表现，细胞内代谢物浓度的改变能够反映细胞基因组的改变和细胞对于外部刺激的响应，因而，获取细胞代谢物信息对于系统地了解细胞的性质和功能、筛选药物以及寻找用于分型的生物标志物至关重要。

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞，具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，免疫学研究中常采用细菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激RAW264.7细胞造炎症反应模型。巨噬细胞的状态及其功能发挥与细胞代谢密切相关，其自身代谢水平的差异甚至能够影响其极化状态，从而决定了不同的功能[3]。因此，利用RAW264.7细胞进行炎症机制的研究具有重要意义。目前，文献报道的RAW264.7细胞炎症模型的研究多是以细胞内弱极性小分子代谢物组为主的脂质组学，揭示了以花生四烯酸为代表的脂质代谢物在炎症细胞中被扰动的情况[4-5]。

然而，炎症细胞中的极性代谢组亦发生改变。Newsholme P等[6]采用Gilford自动记录式分光光度计测定活化的巨噬细胞内的己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，发现2种酶活性均增强，表明糖酵解途径和磷酸戊糖途径代谢加强。Western blot实验结果证明活化的巨噬细胞内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达增强，表明精氨酸的iNOS代谢通路增强。RAW264.7细胞炎症模型的胞内极性代谢物组发生了改变，但是针对其细胞内极性代谢物组的研究尚未见报道。

因此，本文针对RAW264.7细胞内极性小分子代谢物组，对细胞代谢物提取溶剂及检测条件进行优化，建立基于UPLC-Q-TOF/MS的RAW264.7细胞极性代谢物检测方法，进行细胞代谢指纹分析，明确RAW264.7细胞炎症模型的差异代谢物，发现炎症扰动的细胞代谢通路，推测RAW264.7细胞极化过程，为揭示炎症细胞的生物化学变化基础提供数据支撑，同时为细胞极性代谢物组的代谢指纹分析提供了方法学参考。

1 材料

1.1 仪器与试剂

CO₂细胞培养箱（Thermo Scientific 公司）；ACQUITY I-Class超高效液相色谱仪；Waters Xevo-G2-SQ-TOF-MS质谱系统（美国Waters公司）；D-3750 Osterode 高速冷冻离心机（德国Thermo Fisher公司）；Millipore Synergy UV型超纯水机（美国Millipore公司）；水浴氮吹仪（北京成盟伟业科技有限公司）；xw-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；多功能酶标仪（Thermo Scientific 公司）；100 mm细胞培养皿（美国Corning公司）。

胎牛血清（美国Corning公司）、DMEM细胞培养基（Hyclone 公司）；胰蛋白酶、PBS（中国Solarbio公司）；一氧化氮测试试剂盒（普利莱公司）；乙腈、乙酸铵（LC-MS级，美国Fisher Scientific公司）；甲醇（HPLC级，美国Fisher Scientific公司）；LPS（Sigma 公司）；其余试剂至少为分析纯。

1.2 细胞来源

小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自中国科学院协和细胞资源中心。

2 方法

2.1 细胞培养

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞用含10%胎牛血清、青霉素（1×105 U·L^-1）及链霉素（100 mg·L^-1）的DMEM培养基培养于37 ℃，5% CO₂的培养箱中培养。六孔板中每孔接种1×10⁶个细胞，孵育24 h后炎症模型组加入LPS，使其终质量浓度为100 μg·L^-1，正常组加入相同体积培养基，每组平行培养6份。培养24 h后进行样品制备。

2.2 Griess试剂盒检测培养基中NO含量

按照试剂盒说明书制备NO标准曲线。吸取50 μL培养基上清液于96孔细胞培养板中，加入50 μL Griess R1试剂，室温避光静置5 min，各孔再加入50 μL Griess R2试剂，室温避光静置5 min，酶标仪540 nm下检测吸光度，并用校准曲线确定实验各组NO的浓度。

2.3 细胞样品制备

去除培养基，用4 mL 37 ℃超纯水清洗2遍，液氮淬灭。加入1 mL含有5 μmol·L^-1α-氨基庚二酸内标的MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）提取溶剂，用细胞刮刀将细胞刮下，该操作置于冰上，提取溶剂转移至1.5 mL离心管中，涡旋30 s，在液氮-室温下反复冻融循环2次使细胞破碎，4 ℃以13 500 r·min^-1离心15 min后取上清液，在检测前储存在-80 ℃冰箱中。检测前将上清液在室温下用氮气吹干，残渣用50%乙腈复溶，进行LC-MS分析。

2.4 色谱条件

采用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；流动相A：含有5 μmol·L^-1的乙酸铵水溶液（pH 9.9）；流动相B：乙腈；流速：0.4 mL·min^-1；梯度洗脫程序：0～1.0 min，0～99%B；1.0～5.0 min，99%～75%B；5.0～6.0 min，75%B；6.0～8.0 min，75%～70%B；8.0～9.5 min，70%～65%B；9.5～10 min，65%～99%B。

2.5 质谱条件

质谱系统采用电喷雾离子源，负离子模式扫描；扫描范围m/z 50～1 000；离子源参数毛细管电压为2 000 V，锥孔电压为40 V，离子源温度为100 ℃，鞘流气为氮气，900 L·h^-1，鞘流气温度为450 ℃，扫描时间为0.2 s，碰撞气体为氩气。低能量扫描时碰撞能量为6 eV，高能量扫描时碰撞能量为10～40 eV。

2.6 方法学考察

在确定MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）为最佳细胞代谢物提取溶剂后进行了方法学考察。方法学考察部分包括精密度、重复性、样品稳定性及系统稳定性4个考察内容。吸取等量的细胞代谢物提取液，混合均匀，作为质控样本（QC）。精密度考察方法是1个QC样本平行进样6次，分别计算峰面积及保留时间的相对标准偏差。重复性考察方法是平行制备6份QC样本，每份进样1针，分别计算峰面积及保留时间的相对标准偏差，样品稳定性考察是平行制备6份QC样本，4 ℃放置12 h，进样分析，分别计算峰面积及保留时间的相对标准偏差。系统稳定性考察是每8个样品随行一针QC样本，分别计算峰面积及保留时间的相对标准偏差。

2.7 数据处理与分析

NO含量检测结果采用SAS 8.2统计软件进行统计学处理。所有数据用±s表示，组间比较用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

将LC-MS采集到的数据导入ProgenesisQI软件（Waters 公司），对色谱峰进行峰提取、峰匹配、峰对齐、峰识别以及归一化处理，得到的数据再导入EZinfo2.0软件进行多变量分析，选取变量权重值VIP>1，并结合S-plot图筛选正常组和炎症模型组细胞的代谢物谱差异，采用t检验对上述差异代谢产物进行统计学分析，P<0.05有统计学差异。差异性代谢产物的结构依据碎片离子（MSE）信息及HMDB，METLIN，LIPID，KEGG等数据库信息进行鉴定。

3 结果与讨论

3.1 Griess试剂盒检测培养基中NO含量结果

用一系列对照品浓度与其对应的吸光度A作标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程为y=115.41x-6.962 2，R²=0.999 9。将每组样品测得的A代入该直线回归方程中，即得到相应的NO含量。加入LPS后培养24 h，正常组RAW264.7 细胞NO分泌量为0.80 μmol·L^-1，模型组RAW264.7 细胞NO分泌量为7.01 μmol·L^-1，LPS明显提高了RAW264.7细胞NO的分泌（P<0.01），说明造模成功。

3.2 细胞提取方法的优化

本研究采用超纯水冲洗细胞，液氮淬灭，同时考察了4种提取溶剂对细胞代谢物检测的影响，这4种提取试剂包括MeOH，ACN，MeOH-ACN-H₂O（2∶2∶1），MeOH-CHCl₃-H₂O（8∶1∶1）。按照2.3项样品制备方法，分别采用4种提取试剂制备样品并进行检测，见图1A，发现MeOH-CHCl₃-H₂O作为提取溶剂时色谱峰个数较多。本文选择了部分常见极性代谢物来评价4种提取溶剂的提取效率，每种代谢物的相对提取率采用内标物进行标准化，并将ACN组代谢物的相对提取效率设为100%作为参照，发现采用MeOH-CHCl₃-H₂O作为提取溶剂时极性代谢物的相对提取率高，见表1。主成分分析是以较少个数的主成分来反映原始数据的主要信息，因此，PCA图中点的聚集情况可以表明样品间变异性。由4种提取溶剂制备样品的PCA图，见图1B。发现，采用MeOH-CHCl₃-H₂O作为提取剂同组样品间稳定性最高。因此选取MeOH-CHCl₃-H₂O作为RAW264.7细胞极性代谢产物的提取溶剂。

3.3 分析条件的优化

3.3.1 色谱条件优化 细胞的代谢途径复杂多样，研究表明，LPS刺激巨噬细胞后，细胞的糖代谢、氨基酸代谢、脂代谢都发生了改变，为全面表征其代谢产物变化，本研究考察色谱柱类型、流动相组成和离子检测模式。实验中分别采用T3色谱柱和BEH Amide色谱柱进行比较，发现BEH Amide因其酰胺官能团同时具有氢原子受体和供体位点，极性代谢物保留时间延长。调整流动相组成，发现使用含5 mmol·L^-1乙酸铵的水（pH 9.9）-乙腈流动相体系，采用2.4項所述的流动相梯度进行洗脱，分离效果最佳。

3.3.2 质谱条件优化 该文对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、鞘气流速及其温度、扫描时间、低能量通道碰撞能量以及高能量碰撞能量等参数进行了优化，最终以检出色谱峰的数量和强度为指标确定了质谱检测条件。针对RAW264.7细胞内极性小分子代谢物组，包括糖酵解产物、三羧酸循环产物、氨基酸代谢产物等极性代谢物，通过考察同一代谢产物在正、负离子2种检测模式下的出峰情况及准分子离子峰的响应强度，发现三羧酸循环产物和磷酸糖类化合物只在ESI^-下有信号，氨基酸类化合物和腺苷类化合物在2种检测模式下均有信号，因此本研究选择负离子模式进行数据采集。

3.4 分析方法考察

在总离子流图上选取内标α-氨基庚二酸其保留时间为6.42 min，m/z为174.079 4，以及tR，m/z分别为4.24 min，218.100 3；5.45 min，124.008 7；6.87 min，565.049 3；7.17 min，306.073 6这5个色谱峰进行代谢组学方法学考察，计算保留时间与峰面积的RSD。保留时间的精密度、重复性、系统稳定性的RSD分别为0.050%～0.19%，0.030%～0.40%，0.060%～1.0%，4 ℃放置12 h稳定性的RSD为0.060%～1.3%。峰面积的精密度、重复性、系统稳定性的RSD分别为0.23%～1.5%，0.16%～0.87%，0.34%～1.9%，4 ℃放置12 h的稳定性的RSD为0.32%～1.2%。方法学验证结果表明操作和仪器均能进行代谢组学分析。

在最优UPLC-MS条件下，分别对正常组、模型组细胞样品进行检测，得到细胞代谢指纹图谱，见图2，差异部分主要出现在5～7 min处，这些部位可能存在潜在炎症生物标志物。

3.5 与炎症相关差异代谢物的寻找

将UPLC-Q-TOF/MS数据导入ProgenesisQI软件，按照2.7项操作处理数据后，采用OPLS-DA模型进行多维统计分析，筛选VIP>1的峰作为潜在差异代谢物。正常组与模型组的OPLS-DA得分图和S-Plot图，见图3。通过HMDB和METLIN数据库搜索差异物母离子和子离子的精确质荷比，初步鉴定了17个潜在差异代谢物，见表2。

将鉴定出的差异代谢物输入MPetA数据库中，构建代谢通路图，见图4。代谢通路分析表明，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢通路与LPS诱导的炎症反应相关。

LPS刺激会导致细胞内发生“Warburg效应”，即糖酵解和磷酸戊糖途径作用加强，而线粒体内的有氧分解减弱，表现为葡萄糖的大量摄取、高糖酵解速率和核酸合成速率等变化。UDP-葡萄糖醛酸由葡萄糖通过糖醛酸途径生成，是葡糖醛酸的活性供体，也是UDP-单糖由六碳糖转变为五碳糖的关键底物。与正常组相比，模型组中UDP-葡萄糖醛酸含量显著升高，是正常组的4倍，表明糖醛酸途径代谢增强。UDP-葡萄糖醛酸代谢生成的葡萄糖醛酸参与抗坏血酸代谢、磷酸肌醇代谢等代谢活动中。

LPS刺激巨噬细胞使得细胞线粒体氧化磷酸化水平降低，三羧酸循环产物累积，尤其是琥珀酸。Abhishek K Jha等[7]采用平行的代谢组学与转录组学数据网络集成发现被LPS激活的RAW264.7细胞在异柠檬酸脱氢酶处和琥珀酸处发生了代谢中止，即异柠檬酸不生成α-酮戊二酸而生成衣康酸，琥珀酸不再继续代谢成延胡索酸[8]。累积的琥珀酸主要来源于谷氨酰胺代谢，γ-氨基丁酸旁路对此也有贡献[9]。实验结果表明，与正常组相比，炎症模型组中的琥珀酸、衣康酸含量升高，延胡索酸含量下降，其中模型组琥珀酸含量是正常组的4.59倍，模型组衣康酸含量是正常组的2.05倍，说明琥珀酸和衣康酸可以作为RAW264.7炎症细胞的生物标志物。

炎症反应可改变机体的蛋白质代谢和氨基酸需要，这主要是因为细胞因子（如IL-1，IL-6，TNF-α）分泌的增加。在免疫反应中，氨基酸将发生重分配并主要用于合成参与炎症和免疫反应的蛋白质以及参与免疫细胞增殖和其他免疫反应的重要化合物[10-11]。实验结果中谷氨酰胺、缬氨酸、鸟氨酸含量升高，天冬氨酸含量降低，涉及了2个代谢通路，即丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢通路，和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成通路。谷氨酰胺与谷氨酸可以相互转化，谷氨酸代谢生成γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸进一步代谢生成琥珀酸。谷氨酰胺在谷氨酰胺转酰胺酶作用下是将氨基氮转移至不同底物上，为其他代谢反应提供氮源[12]。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸属于支链氨基酸，本实验筛选出的差异代谢物为缬氨酸，与正常组比较，炎症模型组中缬氨酸含量明显升高，其原因为细胞因子的合成需要缬氨酸等支链氨基酸的参与。

实验结果中模型组磷酸乙醇胺含量显著升高，磷酸乙醇胺是神经酰胺的代谢产物之一，表明模型组中神经酰胺代谢高于正常组。神经酰胺是鞘磷脂信号途径的中心分子，参与激活多种蛋白激酶和蛋白磷酸酶，在调节细胞免疫方面起重要作用。炎症细胞中上调的花生四烯酸含量，分泌的白介素、肿瘤坏死因子-α等都可以激活中性鞘磷脂酶，水解鞘磷脂，导致细胞中神经酰胺含量升高[13]。

4 结论

本文提出了1种能够高效、稳定提取RAW264.7细胞中极性代谢产物的方法，并采用UPLC-Q-TOF/MS技术对正常细胞与炎症细胞进行分析，获得了代谢物图谱，结合多元统计分析手段研究正常细胞与炎症细胞的图谱变化情况，结果表明，炎症细胞与正常细胞的代谢物谱图有显著变化。通过对一些具有显著性差异的物质进行初步鉴定，得到了17种代谢差异物。与正常细胞相比，炎症细胞在蛋白质代谢、磷脂代谢、糖代谢方面发生不同程度的紊乱，与文献报道的采用CE-TOF/MS、氨基酸分析仪检测结果基本相符[14]，证明该方法可以表征RAW264.7细胞极化，为抗炎药物研究提供了新的研究方法和思路。

[参考文献]

[1] Fei F， Bowdish D M E， Mccarry B E. Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS[J]. Anal Bioanal Chem，2014，406（15）：3723.

[2] 李瑩，傅超美，任波，等. 基于MI-RI大鼠心肌细胞代谢组学研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制[J]. 中国中药杂志，2014，39（16）：3166.

[3] Osborn O， Olefsky J M. The cellular and signaling networks linking the immune system and metabolism in disease[J]. Nat Med，2012，18（3）：363.

[4] 赵丽丽. NSAIDs干预RAW264.7细胞炎症模型甘油磷脂代谢的UPLC-Q-TOF/MS分析[D]. 广州：广东药学院，2012.

[5] Kita Y， Takahashi T， Uozumi N， et al. Pathway-oriented profiling of lipid mediators in macrophages[J]. Biochem Bioph Res Co，2005，330（3）：898.

[6] Newsholme P， Curi R， Gordon S， et al. Metabolism of glucose， glutamine， long-chain fatty acids and ketone bodies by murine macrophages[J]. Biochem J，1986，239（1）：121.

[7] Jha A K， Huang S C， Sergushichev A， et al. Network integration of parallel metabolic and transcriptional data reveals metabolic modules that regulate macrophage polarization[J]. Immunity，2015，42（3）：419.

[8] O Neill L A J. A broken krebs cycle in macrophages[J]. Immunity，2015，42（3）：393.

[9] Tannahill G M， Curtis A M， Adamik J， et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1β through HIF-1α[J]. Nature，2013，496（7444）：238.

[10] 井明艳，刘波静，孙建义，等. 氨基酸代谢与免疫反应[J]. 中国畜牧杂志，2007，43（5）：37.

[11] 祖克热古丽·吾买尔尼亚孜，哈木拉提·吾甫尔， 买吾拉尼江·依孜布拉，等. 异常黑胆质成熟剂对移植性宫颈癌（U27）肿瘤模型小鼠血清的代谢组学研究[J].中国现代应用药学，2015，32（8）：905.

[12] 徐咏全，张蓓，张克旭. 谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶研究进展[J]. 生物技术通讯，2003（6）：535.

[13] 金道忠，朱兴族. 神经酰胺代谢及凋亡信号调节[J]. 生命科学，2006（5）：481.

[14] Sugimoto M， Sakagami H， Yokote Y， et al. Non-targeted metabolite profiling in activated macrophage secretion[J]. Metabolomics，2012，8（4）：624.

[责任编辑 张燕]