吴超+朱卫丰+嵇琴+周莹+章明+黄鑫+彭淑红

[摘要] 探讨女贞子对大鼠肝脏细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）活性的影响及可能的DNA甲基化机制。实验采用女贞子的水提物按2.0 g·kg^-1和6.0 g·kg^-1灌胃大鼠30 d，处死大鼠后，取肝脏测定COX活性、COX的亚基之一COX4I1蛋白浓度、测定Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因mRNA表达水平、TET1和DNMT3A的蛋白水平以及检测Cox4i1DNA甲基化频率。结果显示女贞子低剂量和高剂量能显著性升高COX的活性和COX4I1的浓度（P<0.05）；有降低TET1蛋白和DNMT3A的蛋白表达量的趋势；但未显著改变Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因mRNA表达。与空白对照组相比，女贞子高剂量组甲基化频率有降低的趋势但未达到显著水平。该研究表明：女贞子对大鼠肝脏的COX酶活性有促进作用，其可能通过促进COX4I1的蛋白量增加实现；女贞子对DNMT3A的蛋白表达有降低趋势，其可能是Cox4i1DNA甲基化频率有降低趋势的原因。女贞子对于DNMT3A和TET1的蛋白表达可能有同向调节作用，具体机制仍不明确。

[关键词] 女贞子； 能量代谢； COX4； COX4I1； DNMT3A； TET1

[Abstract] The study aims to investigate the effect of Ligustri Lucidi Fructus on cytochrome c oxidase（COX） activity in rat hepatic tissues and explore its possible mechanism of DNA methylation. Male SD rats received aqueous extract of Ligustri Lucidi Fructus （2.0，6.0 g·kg^-1） by intragastric administration for 30 d. After the rats were sacrificed， hepatic tissues of rats were taken to detect COX activity， protein concentration of COX4I1， TET1 and DNMT3A protein levels， mRNA expression levels of Cox4i1， Dnmt3a and Tet1， and determine the DNA methylation frequency of Cox4i1.Results showed that both low and high doses of Ligustri Lucidi Fructus could significantly increase COX activity and concentration of COX4I1（P<0.05）， with a decreasing tendency of both TET1 protein and DNMT3a protein expression； however， mRNA expression levels of Cox4i1， Dnmt3a and Tet1 were not significantly changed by Ligustri Lucidi Fructus. In addition， DNA methylation frequency of Cox4i1 in high dose group showed a declining tendency as compared with the blank control group， but without significant difference.These results indicated that Ligustri Lucidi Fructus had promotive effect on hepatic COX activity in rats， which may be achieved by increasing protein content of COX4I1. Moreover， a decreased tendency of DNMT3A protein could be one of the reasons for the lower trend of Cox4i1 methylation rate. In addition， Ligustri Lucidi Fructus may regulate the expression levels of DNMT3A and TET1 in the same direction and its mechanism is not clear.

[Key words] Ligustri Lucidi Fructus； energy metabolism； COX4； COX4I1； DNMT3A； TET1

女貞子为木犀科植物女贞Ligustum lucidum的干燥成熟果实，其性凉，《本草纲目》记载其具有养阴气，平肝火的作用。很多研究结果都表明寒凉药有抑制能量代谢的作用[1-3]。线粒体氧化磷酸化是机体能量ATP生成的主要方式之一，而细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）是线粒体呼吸链的末端组分，也是氧化磷酸化的重要组成部分。DNA甲基化是新兴学科——表观遗传学的重要研究内容，是目前研究最为深入的一种表观遗传修饰机制，也是调控基因表达的一种重要的修饰方式。本文首先探讨了女贞子对大鼠肝脏COX的活性以及其重要调节亚基COX4I1蛋白量的影响，然后从DNA甲基化角度探索女贞子对DNA甲基化转移酶和去甲基化酶的转录水平和蛋白水平的影响，并研究了COX调节亚基基因Cox4i1的DNA甲基化水平以及mRNA水平，以期从DNA甲基化水平探讨女贞子干预COX酶活性的机制。

1 材料

1.1 药物及试剂

女贞子购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，产品批号1307007，产于江西，经江西中医药大学邓可众副教授鉴定。细胞色素c氧化酶活性测定试剂盒（GENMED，批号11-42413-12）；细胞色素c氧化酶4亚基1检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，批号L20141023573）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20130926）；RNA保护液（天根生化科技有限公司，批号M1705）；RNA提取试剂盒（Promega公司，批号20130601）；RNA反转录试剂盒（Promega公司，批号000096365）；荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司，批号AK2901）；DNA提取试剂盒（Promega公司，批号0000105207）；DNA甲基化试剂盒（Epigenetics公司，批号ZRC176927）；GoTaq酶（Promega公司，批号000076225）；EastePTM凝胶及PCR回收试剂盒（批号20140201）；Peasy-T3 cloning Kit（全式金公司，批号I30807）；TET1（Y14）一抗（Santa Cruz Biotechnolog.Inc，批号SC-163446），二抗兔抗山羊（中杉金桥，批号2B-2306）；DNMT3A（H-295）一抗（Santa Cruz Biotechnolog.Inc，批号SC-20703），二抗山羊抗兔（中杉金桥，批号2B-2301）；β-actin（中杉金桥，批号：一抗TA-09，二抗2B-2305）。所用引物通过引物设计软件oligo6自行设计，序列见表1，均由上海生工合成。

药物制备：药物水提液由本实验室制备。取女贞子药材1.2 kg加入10倍量双蒸水，浸泡60 min，置于煎药壶中煎药，于沸腾后煎60 min，用纱布趁热滤出药液，残渣再加入8倍量双蒸水，于沸腾后煎煮60 min。合并2次药液，浓缩后制成含生药量2.9 kg·L^-1（用药前稀释），-20 ℃放置备用。

1.2 动物

SD大鼠，雄性，200～250 g，湖南斯莱克景达实验动物中心提供，许可证号SCXK（湘）2011-0003。给予大鼠标准饲料和饮用水。

1.3 仪器

SpectraMaxPlus384全波长酶标仪；Tissuelyser-24全自动样品快速研磨仪（上海净信科技）；SIGMA3-18K高速低温离心机（德国SIGMA公司）；荧光定量PCR仪（ABI stepone plus）；梯度PCR仪（ABI Veriti）；HH-600电热恒温水浴锅（金坛市万华实验仪器厂）；微量移液器（Eppendorf）；ChemiDoc XRS⁺化学发光凝胶成像系统（美国伯乐公司）；SUB02水平电泳仪（北京鸿涛基业科技发展有限责任公司）；涡旋混匀器（IKA VORTEX2）；JD1000-3千分之一电子秤（沈阳龙腾）；IMS-70制冰机（常熟雪科）；G154TW型高压灭菌器（美国致微仪器有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组与给药

大鼠30只，按体重随机分为3组，即空白对照组、女贞子低剂量组、女贞子高剂量组，每组10只。各组动物适应性喂养3 d之后开始灌胃给药，灌胃容积为10 mL·kg^-1，每天1次，共给药30 d。每天给药剂量：女贞子低剂量生药2 g·kg^-1，女贞子高剂量生药6 g·kg^-1，空白对照组给予等容量的蒸馏水。

2.2 实验取材

于实验第30天，末次灌胃后禁食不禁水12 h，将大鼠麻醉，取出肝脏后迅速按照顺序分成若干份，将提RNA的组织装入RNA保护液中，其余肝脏组织分别用锡箔纸包好，迅速放入液氮中，之后转移至-80 ℃冰箱保存备用。

2.3 大鼠肝脏COX4I1浓度测定

准确称量一定量肝脏组织（约0.2 g），按质量体积比加9倍生理盐水，制成10%的匀浆，2 000 r·min^-1离心10 min，取上清液按试剂盒说明进行肝脏COX4I1浓度的测定。

2.4 大鼠肝脏COX活性测定

准确称量一定量肝脏组织（约0.2 g），按质量体积比加9倍生理盐水，制成10%的匀浆，2 000 r·min^-1离心10 min，取上清液按试剂盒说明进行肝脏COX活性的测定，组织蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。

2.5 SYBR Green實时定量PCR检测Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因的表达

2.5.1 mRNA提取及反转录 取肝脏组织30～100 mg，按照Promega RNA提取试剂盒说明书步骤提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，全波长酶标仪测定RNA的纯度和浓度。所提取的RNA于-80 ℃储存备用。按反转录试剂盒说明进行cDNA合成。

2.5.2 Cox4i1，Dnmt3a，Tet1和β-actin扩增效率的检测和基因表达量检测 参照Kenneth[4] 的方法及文献[2]。

2.6 Western blot检测DNMT3A和TET1蛋白表达的影响

2.6.1 提取和测定蛋白浓度 常规方法提取肝脏和骨骼肌组织总蛋白，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。

2.6.2 SDS-PAGE电泳、转膜 5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜数次。分别加入一抗，放置于4 ℃摇床孵育过夜。第2天，洗膜后加入1∶1万辣根过氧化物酶标记的二抗（中杉金桥），室温孵育1 h，洗膜数次。将膜放入显色液中（TECAN），室温下孵育1 min。放入化学发光凝胶成像系统显影。β-actin一抗是1∶2 000，二抗是抗鼠1∶1万，DNMT3A一抗是1∶1 000，二抗是抗兔1∶2万，TET1一抗是1∶100，二抗是抗山羊1∶3万。

2.6.3 分析 显色后用Quantity one分析软件分析条带灰度，以目的基因的条带灰度与内参β-actin的灰度比值表示蛋白的表达水平。

2.7 重亚硫酸盐法检测基因Cox4i1 DNA甲基化频率

2.7.1 DNA提取及重亚硫酸盐处理和纯化回收 取10～20 mg肝脏组织按Promega DNA提取试剂盒提取DNA。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，全波长酶标仪测定DNA的纯度和浓度。提取后的DNA按照Epigenetics甲基化试剂盒说明书步骤得到甲基化DNA产物。

2.7.2 扩增和纯化回收 第一次PCR体系25 μL，甲基化DNA模板1.5 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水9 μL。反应条件：预变性94 ℃ 10 min，变性每次循环94 ℃ 1 min，退火60 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，后延伸72 ℃ 10 min。第2次PCR体系25 μL，第1次PCR的DNA产物2 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1N下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水8.5 μL。反应条件：预变性94 ℃ 5 min，变性每次循环94 ℃ 1 min，65 ℃ 30 s每次循环降1 ℃及延伸72 ℃ 30 s，共10个循环。再变性每次循环94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共19个循环，后延伸72 ℃ 10 min，之后得到扩增后甲基化DNA产物，之后按照Transgen DNA回收试剂盒说明书步骤切胶回收。

2.7.3 蓝白斑筛选和大肠杆菌质粒提取 将连接产物加到感受态细胞中于固体培养基中培养，再将固体培养基上生长的白色菌落挑到加了氨苄青霉素的液体培养基中培养。之后按试剂盒说明提取大肠杆菌质粒。

2.7.4 质粒测序 质粒送上海生物工程公司进行测序。

2.8 统计学方法

采用SPSS 20.0进行统计分析。资料经过方差齐性检验，数据用±s表示。药物组与对照组间的差异比较用独立样本的t检验法。

3 结果

3.1 女贞子对大鼠肝脏COX活性的影响

与对照组相比，女贞子低剂量和高剂量组的COX的活性均有升高趋势，其中低剂量女贞子组的COX活性显著增加（P<0.05），见图1。

3.2 女贞子对大鼠肝脏COX4I1浓度的影响

与对照组相比，女贞子低剂量和高剂量组的COX4I1的浓度均有所升高，并达到了统计学差异（P<0.05），见图2。

3.3 女贞子对Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因表达量的影响

低剂量和高剂量女贞子对大鼠肝脏Cox4i1，Dnmt3a，Tet1基因表达量与对照组相比，差异不明显，见图3。

3.4 女贞子对DNMT3A和TET1蛋白表达的影响

与对照组相比，女贞子低剂量和高剂量组的DNMT3A的蛋白表达有下降趋势，TET1的蛋白表达有下降趋势，见图4，表2。

3.5 女贞子对cox4i1基因DNA甲基化频率的影响

与对照组比较，高剂量女贞子组甲基化水平有所下降，见图5（P=0.089）。

4 讨论

线粒体是机体能量代谢的主要部位，是能量ATP的生成、利用及产热作用发挥的主要场所。线粒体通过2条主要的呼吸链进行氧化磷酸化而产生ATP，为机体提供能量。细胞色素c氧化酶（COX），也称复合体IV，它是线粒体2条呼吸链的共有末端组分，催化了电子从细胞色素c到氧原子的传递，该反应与质子从线粒体机制泵入膜间隙偶联，因此电子的传递有助于能量储存于化学梯度中。它是线粒体氧化磷酸化的限速酶，在整个能量代谢中发挥着重要的作用。而COX4是细胞色素最大的核编码亚基。该亚基与其他一些核编码亚基（除了Va，Vb和

VIb）位于COX酶的跨膜螺旋区。哺乳动物COX4包括COX4I1和COX4I2。本研究发现女贞子低剂量灌胃30 d之后能显著提高正常大鼠肝脏COX4I1的浓度和COX活性，然而编码该蛋白的Cox4i1的mRNA水平并没有显著变化。一般认为如果COX活性升高，则电子传递链将会受到干扰，会引起ATP合成上升，造成產热增加，似乎违背女贞子寒凉药抑制能量代谢。但是考虑到给药是一个长期过程，恒温动物必定有一个自我调节的过程，可能COX4I1蛋白量的增加就是为机体产生更多的热能以维持体温的相对恒定。Cox4i1的mRNA水平并未受到女贞子的影响，这说明女贞子可能对COX4I1蛋白的合成过程有一定的影响，而对该基因的转录水平影响不显著。另外，也可能是给药过程偏长，在给药早期Cox4i1的mRNA水平有显著增加，从而使其蛋白水平增加，由于蛋白的半衰期要比mRNA长，所以在最后mRNA并未显示显著性变化，而蛋白有显著性改变。因此在以后的试验中采取多时间点取材检测，观察药物的时效性，可能更好反映中药的药效同时有益于研究药物的作用机制。

DNA甲基化是表观遗传学的一种重要方式，是一种可逆的基因修饰，对基因的表达具有重要的调控作用[5-6]。已报道与能量代谢有关的一些基因受到了DNA甲基化的调控。这些基因有：脂肪酸合成酶基因、NADH脱氢酶（泛醌）1β亚复合物6[NADH dehydrogenase （ubiquinone）1beta-subcomplex 6，NDUFB6]基因，丙酮酸脱氢酶复合物α亚基2（pyruvate dehydrogenase complex alpha subunit 2，PDHA2）基因，COX7A1基因，肝脏X受体α（liver X-receptor alpha）基因，过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，coactivator 1alpha，PGC-1α）基因，leptin基因等[7-10]。实验发现四季三黄胶囊（主要由黄芩、黄柏、栀子、大黄等成分组成）可能通过提高动脉粥样硬化（As）小鼠血清DNA甲基化水平和DNMTs水平，从而达降低血清甘油三酯（TG）水平，稳定As斑块的作用[11]。通常情况，基因组的高甲基化导致基因的沉默，而低甲基化促进基因的表达。本实验中女贞子高剂量组与对照组相比Cox4i1基因甲基化水平有所下降，但是未达到显著水平（P=0.089），这可能与统计样本偏少有关（由于经费限制，每组只选3个样本用于BSP克隆测序）。另外该基因的mRNA水平也未出现显著性改变，这说明对于Cox4i1基因甲基化水平的改变还不足于影响到其表达量的变化。尽管女贞子对DNA甲基化酶基因Dnmt3a和去甲基化酶基因Tet1的mRNA水平并没有显著影响，但是DNMT3A蛋白和TET1蛋白表达有下调趋势，这说明女贞子可能对Dnmt3a和Tet1基因的翻译水平有一定的调控作用，也同时表明女贞子可能通过某种机制同向调控了这2种蛋白的表达；而女贞子给药组是Cox4i1基因甲基化水平有所下降，提示有下调趋势的甲基化转移酶可能对于Cox4i1基因的甲基化频率有一定的降低作用。

总之，本实验研究表明女贞子给药30 d对正常大鼠肝脏的COX酶活性有促进作用，其可能通过促进COX4I1的蛋白量升高实现；而该蛋白量的增加可能不是通过调控Cox4i1的转录水平实现；同时，有降低趋势的甲基化酶可能对于Cox4i1甲基化频率有一定的作用；然而，实验也显示女贞子对大鼠肝脏DNA甲基化酶DNMT3A的蛋白量和去甲基化酶TET1蛋白都有降低趋势，这说明女贞子对于这2种蛋白有同向调控的作用，但其具体的调控机制需要进一步明确。

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[責任编辑 张宁宁]