袁小波 唐静

卵巢癌是妇科肿瘤中危害最为严重的恶性肿瘤,严重危害女性的身体健康,该疾病早期难于诊断,病发后难于防治[1]。 目前主要通过手术治疗切除病灶,缓解肿瘤增生,但术后复发概率高[2]。因此,急需开发具有针对性的治疗药物,提高治疗效果,减少疾病复发。 女贞子多糖是木樨科植物女贞子的主要有效成分,其具有抗肿瘤作用[3]。据报道,女贞子多糖可抑制黑色素瘤细胞的粘附能力[4]。 但女贞子多糖对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响鲜有报道。 此外,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)/有丝分裂原活性蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是控制细胞生长过程中最重要的通路之一,可介导细胞的生长与分化,最终加速细胞增殖[5-6]。 相关研究表明,抑制EGFR/MAPK 信号通路可抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭[7]。 而女贞子多糖能否通过调控EGFR/MAPK 信号通路影响卵巢癌细胞恶性生物学行为尚不明确。 因此,本研究主要探究女贞子多糖对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

女贞子多糖(批号:20180526)购于陕西鸿泽生物工程有限公司,胎牛血清(批号:20150410)购于普利莱(北京)基因技术有限公司,pcDNA3.1-EGFR及其对照品由吉玛生物科技有限公司合成,甲基噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试剂盒(批号:20171107)购于上海纪宁生物科技有限公司,凋亡检测试剂(批号:20180923)购于翌圣生物科技有限公司,三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗 体 ( 批 号:20171011)、 EGFR 抗 体 (批 号:20161203)、 p-EGFR 抗体(批号:20170621)、p-P38 MAPK 抗体(批 号: 20190517)、 P38 MAPK 抗 体 ( 批 号:20180620)、B 细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体(批号:20190527)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax) 抗 体 (批 号:20171024)及免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗(批号:20180925)购于abcam 公司。

1.2 主要仪器

荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司,型号:7500);蛋白凝胶成像系统(上海生工生物公司,型号:HE-120)。

1.3 细胞来源

人上皮性卵巢癌HO8910 细胞购于中科院上海细胞研究所。

1.4 细胞培养与分组

将HO8910 细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养于37℃、5% CO2的细胞培养箱中,进行常规细胞传代培养,取对数生长期的HO8910 细胞用于后续实验。

将对数生长期的HO8910 细胞(浓度1×108/L)分别用终浓度为 0 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 女贞子多糖处理48 小时,并命名为对照组、女贞子多糖低剂量组、女贞子多糖中剂量组、女贞子多糖高剂量组。 此外, 另将对数生长期的HO8910 细胞设置为pcDNA-EGFR 组(转染pcDNAEGFR)、 女 贞 子 多 糖 + pcDNA-EGFR 组 ( 转 染pcDNA-EGFR 和10 μg/mL 女贞子多糖共同处理)、女贞子多糖+pcDNA 组(转染 pcDNA 和10 μg/mL女贞子多糖共同处理),各组细胞持续培养48 小时,每组设置6 个复孔。

1.5 MTT 法检测HO8910 细胞增殖

将各组细胞悬液(1×105)在96 孔板中经相应处理干预48 小时后,向每孔加入20 μL MTT,37℃培养4 小时后将培养液倒出,加入150 μL DMSO,混匀后置于摇床持续振荡10 分钟,酶标仪检测490 nm波长处的光吸收值,每组设置6 个复孔,实验重复3 次。

1.6 流式细胞术检测HO8910 细胞凋亡

将各组细胞悬液(1×105)在96 孔板中经相应处理干预48 小时后,离心收集细胞悬液,用5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI 避光孵育 15 分钟后,再加入500 μL PBS 重悬细胞,使用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。 细胞凋亡率(%)= (凋亡细胞数/总细胞数) ×100%,每组设置 6 个复孔,实验重复3 次。

1.7 Western blot 检测 HO8910 细胞中 EGFR、p-EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bcl-2、Bax 蛋白表达

收集经相应处理干预48 小时后的各组细胞,用放射免疫沉淀分析法(radio immuno precipit ationassay,RIPA)裂解液提取总蛋白,将蛋白质进行定量、电泳、转膜,封闭后,加入一抗 GAPDH、EGFR、p-EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bcl-2、Bax,均按1 ∶1500 比例稀释,4℃孵育过夜。 清洗三次,加入二抗(1 ∶2000),常温孵育1 小时,清洗3 次,加入增强化学发光剂(enhanced chemilum inescence,ECL)观察蛋白显色情况,Image J 软件分析蛋白条带灰度值,每组设置6 个复孔,实验重复3 次。

1.8 统计学方法

采用软件SPSS 22.0 软件进行统计分析,计量资料均符合正态分布,方差齐,所有数据通过均数±标准差()体现,多组间差异用单因素方差分析进行比较,两两比较采用SNK-q检验,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量女贞子多糖对HO8910 细胞增殖、凋亡的影响

与对照组相比,女贞子多糖低剂量组、女贞子多糖中剂量组、女贞子多糖高剂量组OD 值、Bcl-2蛋白表达量显著降低,细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量显著升高,且呈剂量依赖性(P<0.05)。 见表1、图1 ~2。

图1 流式细胞术检测不同剂量女贞子多糖对HO8910 细胞凋亡的影响

表1 不同剂量女贞子多糖对HO8910 细胞增殖、凋亡的影响(,n=6)

表1 不同剂量女贞子多糖对HO8910 细胞增殖、凋亡的影响(,n=6)

注: 与对照组相比,aP<0.05;与女贞子多糖低剂量组相比,bP<0.05;与女贞子多糖中剂量组相比,cP<0.05。

0.000 0.000 0.000 0.000组别 OD 值(490 nm) 细胞凋亡率(%)0.629±0.041 1.28±0.17 1.64±0.18 0.40±0.11女贞子多糖低剂量组 0.478±0.038a 4.84±0.63a 1.29±0.14a 0.78±0.18a女贞子多糖中剂量组 0.384±0.043ab 16.13±1.48ab 0.93±0.21ab 1.26±0.21ab女贞子多糖高剂量组 0.272±0.036abc 24.47±3.73abc 0.55±0.13abc 1.87±0.14abc F 值 87.430 163.751 46.660 89.381 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH对照组

2.2 不同剂量女贞子多糖对 HO8910 细胞中EGFR/MAPK 信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比,女贞子多糖低剂量组、女贞子多糖中剂量组、女贞子多糖高剂量组 p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。 见表2、图3。

图3 Western blot 检测不同剂量女贞子多糖对HO8910细胞中p-EGFR、EGFR、p-MAPK、MAPK 蛋白表达量的影响

表2 不同剂量女贞子多糖对HO8910 细胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影响(,n=6)

表2 不同剂量女贞子多糖对HO8910 细胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影响(,n=6)

注: 与对照组相比,aP<0.05;与女贞子多糖低剂量组相比,b P<0.05;与女贞子多糖高剂量组相比,cP<0.05。

0.000 0.000组别0.83±0.04 0.80±0.05女贞子多糖低剂量组 0.74±0.05a 0.69±0.04a女贞子多糖中剂量组 0.61±0.07ab 0.53±0.06ab女贞子多糖高剂量组 0.21±0.03abc 0.17±0.04abc F 值 181.556 195.161 P 值p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK对照组

图2 Western blot 检测不同剂量女贞子多糖对HO8910 细胞中Bcl-2、Bax 蛋白表达量的影响

2.3 过表达 EGFR 逆转高剂量女贞子多糖对HO8910 细胞中EGFR/MAPK 信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比,pcDNA-EGFR 组p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 显著升高(P<0.05);与女贞子多糖+pcDNA 组相比,女贞子多糖+pcDNA-EGFR 组 p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 升高,差异有统计学意义(P<0.05)。 见表3 ~4、图4。

表3 过表达EGFR 对HO8910 细胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影响()

表3 过表达EGFR 对HO8910 细胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影响()

6 0.83±0.04 0.80±0.05 pcDNA-EGFR 组 6 0.94±0.06 0.92±0.06 t 值 -3.734 -3.764 P 值对照组0.004 0.004 p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK组别 n

表4 过表达EGFR 逆转女贞子多糖对HO8910 细胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影响(,n=6)

表4 过表达EGFR 逆转女贞子多糖对HO8910 细胞中p-EGFR/EGFR、p-MAPK/MAPK 的影响(,n=6)

0.24±0.05 0.19±0.03女贞子多糖+pcDNA-EGFR 组 0.73±0.04 0.56±0.05 t 值 -18.745 -15.543 P 值p-EGFR/EGFR p-MAPK/MAPK女贞子多糖+pcDNA 组组别0.000 0.000

图4 Western blot 检测各组HO8910 细胞中p-EGFR、EGFR、p-MAPK、MAPK 蛋白表达量

2.4 过表达EGFR 逆转高剂量女贞子多糖对HO8910 细胞增殖、凋亡的影响

与对照组相比,pcDNA-EGFR 组 OD 值、Bcl-2蛋白表达量显著升高,细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量显著降低(P<0.05);与女贞子多糖+pcDNA 组相比,女贞子多糖+pcDNA-EGFR 组 OD 值、Bcl-2 蛋白表达量显著升高,细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。 见表5 ~6、图5 ~6。

图5 流式细胞术检测过表达EGFR 逆转高剂量女贞子多糖对HO8910 细胞凋亡的影响

表5 过表达EGFR 对HO8910 细胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响(,n=6)

表5 过表达EGFR 对HO8910 细胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响(,n=6)

0.629±0.041 1.28±0.17 2.14±0.18 0.47±0.11 pcDNA-EGFR 组 0.741±0.068 0.87±0.19 2.49±0.16 0.25±0.07 t 值 -3.455 3.939 -3.560 4.133 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH对照组组别 OD 值(490 nm) 细胞凋亡率(%)0.006 0.003 0.005 0.002

表6 过表达EGFR 逆转女贞子多糖对HO8910 细胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响(,n=6)

表6 过表达EGFR 逆转女贞子多糖对HO8910 细胞增殖、凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响(,n=6)

0.265±0.042 23.88±3.83 0.62±0.11 1.82±0.13女贞子多糖+pcDNA-EGFR 组 0.452±0.048 3.73±0.39 1.67±0.17 0.72±0.14 t 值 -7.182 12.821 -12.702 14.103 P 值Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH女贞子多糖+pcDNA 组组别 OD 值(490 nm) 细胞凋亡率(%)0.000 0.000 0.000 0.000

图6 Western blot 检测过表达EGFR 逆转高剂量女贞子多糖对HO8910 细胞中Bcl-2、Bax 蛋白表达量的影响

3 讨论

卵巢癌是一种发生在卵巢的恶性肿瘤,近年来在我国发病率仍较高[8]。 该病可使患者产生强烈的腹部疼痛,引发多种消化道症状,严重时甚至危害女性生命[9]。 目前仅能通过手术加以治疗,并通过药物进行缓解,但能有极高的复发率[10]。 开发具有针对性的治疗药物,抑制卵巢癌组织的生长和扩散,成为当前的重中之重[11]。 近年来随着中医药领域进一步发展,通过中药提取物治疗相关疾病的研究逐渐增多,越来越多的证据表明,中药提取物对于癌症细胞的生长具有抑制作用,推测部分中药提取物可用于治疗缓解癌症细胞的增殖[12-13]。 女贞子属木樨科,是植物女贞的果实,被证实具有抗癌效果,目前已被应用于开发抗癌药物,是多种抗癌保健品的成分之一[14]。 相关研究显示,女贞子多糖可通过降低淋巴瘤细胞表面唾液酸含量来抑制淋巴瘤进展[15],表明女贞子多糖具有抗肿瘤作用。 而女贞子多糖能否抑制卵巢癌进展尚不可知。 本研究通过不同剂量的女贞子多糖处理卵巢癌HO8910细胞,结果发现不同剂量女贞子多糖处理后,HO8910 细胞OD 值显著降低,细胞凋亡率显著升高,且呈剂量依赖性,表明女贞子多糖可加速细胞凋亡,抑制细胞增殖,进而抑制卵巢癌进展。

有文献指出,Bax 作为线粒体蛋白,可与线粒体膜结合,促进凋亡因子表达[16]。 Bcl-2 作为抗凋亡蛋白,可减少凋亡因子的产生,抑制细胞凋亡。Bax、Bcl-2 蛋白表达量是评估细胞凋亡水平的重要依据[17]。 本研究发现,不同剂量的女贞子多糖处理卵巢癌细胞后,Bcl-2 蛋白表达量显著降低,Bax 蛋白表达量显著升高,表明女贞子多糖通过调控Bax、Bcl-2 蛋白表达,促进细胞凋亡,但具体的作用机理仍有待进一步探索。

EGFR 作为常见的细胞膜受体,广泛存在于人体多种类型的细胞中,在细胞生长过程中发挥重要作用,可参与启动细胞周期,加速细胞繁殖[18]。EGFR 同样参与癌细胞的增生,促进肿瘤产生,例如其在卵巢癌组织中高水平表达,被认为是评估卵巢癌恶化程度的重要标志[19]。 EGFR 的磷酸化可进一步激活MAPK 信号通路,促进肿瘤细胞的快速生长[20]。 据报道,抑制EGFR/MAPK 通路可抑制乳腺癌进展[21]。 本实验发现,与对照组相比,过表达EGFR 后,EGFR、MAPK 磷酸化程度显著升高,OD值、Bcl-2 蛋白表达量显著升高,细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量显著降低,表明EGFR/MAPK 信号通路可促进卵巢癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。 此外,有研究表明,以女贞子作为主要成分的中药可参与调控EGFR,缓解非小细胞肺癌进展[22],推测女贞子多糖可能通过调控EGFR/MAPK 信号通路,抑制卵巢癌细胞增殖,促进细胞凋亡。 本研究显示,与对照组相比,不同剂量的女贞子多糖处理卵巢癌细胞后,EGFR、MAPK 磷酸化程度显著降低,表明女贞子多糖很可能通过调控EGFR/MAPK 信号通路发挥作用,为进一步验证女贞子多糖在通路中是否发挥作用,本实验在高剂量女贞子多糖处理的同时再转染pcDNA-EGFR 来干预HO8910 细胞,结果显示,过表达EGFR 减弱了高剂量女贞子多糖对HO8910 细胞增殖的抑制,以及细胞凋亡的促进作用,进一步验证相关推论。

综上所述,女贞子多糖可能通过抑制EGFR/MAPK 信号通路,进而抑制HO8910 细胞增殖,促进细胞凋亡。 然而,本研究尚存在不足之处,女贞子多糖是否还通过其他作用通路间接参与调控卵巢癌细胞增殖和凋亡,还有待进一步实验加以说明。