丘卫恩，陈允，周道祥，邝锦波，林丹，李波

（广州市越秀区中医医院，广东 广州 510030）

外周血CD4+CD25+Treg细胞在慢性乙型病毒性肝炎患者的表达水平及其与自身抗体的相关关系探讨

丘卫恩，陈允，周道祥，邝锦波，林丹，李波

（广州市越秀区中医医院，广东 广州 510030）

目的 探讨外周血CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）在慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者中的表达水平及其与自身抗体的关系。方法选取2013年1月至2015年12月于我院首次就诊且未做任何治疗的CHB患者156例，分为A组（自身抗体阳性组，70例）和B组（自身抗体阴性组，86例）。同时，选取同期来院行健康查体的正常人50例作为C组。结果 A组的CD4+CD25+T细胞数显著低于B组和C组（P＜0．05）。A组的HBV-DNA和ALT水平均显著高于B组（P＜0．05）。随着外周血CD4+CD25+Treg细胞百分数的增加，自身抗体数逐渐降低，二者呈显著负相关关系（r＝-0．519，P＜0．05）。结论 CD4+CD25+Treg细胞可能具有抑制CHB患者产生自身抗体的作用，可避免机体免疫耐受的产生和发展，从而达到减轻肝炎病情的目的。

CD4+CD25+Treg细胞；乙型病毒性肝炎；自身抗体

研究［1］表明，慢性乙型肝炎（CHB）的发生发展与肝脏自身的免疫病理损伤及肝外自身免疫系统的异常密切相关。自身免疫性肝病相关的自身抗体在CHB患者体内存在较高的检出率，且上述抗体阳性的患者往往病情迁延难愈，复发率较高，成为治疗的难题。但其在肝脏免疫炎性损伤中的免疫调节作用及在治疗预后中的评估价值尚不清楚。近年研究［2］显示，CD4＋CD25＋调节性T细胞（Treg细胞）作为具有免疫抑制功能的细胞亚群，可负反馈地抑制T细胞的功能，在自身免疫疾病发生和发展中发挥重要作用。当机体感染HBV病毒时，免疫平衡被打破，最终导致机体多种自身抗体的产生，诱发肝细胞的免疫损伤和炎性反应过程。本研究检测70例自身抗体阳性CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg细胞的表达水平，旨在探讨CD4＋CD25＋调节性T细胞在CHB患者免疫调节机制中的作用。

1 资料与方法

1．1 一般资料选取2013年1月至2015年12月于我院首次就诊且未做任何治疗的CHB患者共156例，其中，男91例，女65例，年龄17～76岁，平均年龄（39．7±27．9）岁。所有患者的诊断均参照2000年病毒性肝炎防治方案的诊断标准确诊为CHB，并排除甲、丙、丁及戊型等其他肝炎病毒感染，自身免疫性肝炎，重型肝炎及肝硬化失代偿患者。根据患者自身抗体表达情况，若存在1项抗体表达为阳性者则视为自身抗体表达阳性，将156例患者分为A组（自身抗体阳性组，70例）和B组（自身抗体阴性组，86例）。同时，选取同期来院进行健康体检的正常人50例作为C组，其中，男性28例，女性22例，年龄19～76岁，平均年龄（38．1±24．3）岁。三组在年龄、性别等方面无统计学差异（P＞0．05），具有可比性。

1．2 方法①斑点免疫层析法检测自身抗体的表达：采用斑点免疫层析法检测三组患者的自身抗体表达情况，包括抗单链DNA抗体（SS－DNA）、抗双链DNA抗体（ds－DNA）、抗核抗体（ANA）、抗肝／肾微粒体抗体（LKM）及抗线粒体IgM抗体（AMA）。抗体试剂盒由美国BD公司生产，严格按照试剂盒说明书进行检测。②流式细胞仪检测CD4＋CD25＋T细胞的表达：抽取各组研究对象的清晨空腹肘静脉血4 mL装于肝素钠抗凝管中混匀后，以1∶1的比例采用PBS溶液进行稀释，通过淋巴分离液对稀释液进行分离，得到单个核细胞（PBMC），并调整细胞数，制成浓度为1×107／mL的细胞悬液，分别吸取抗人CD4－FITC及CD25－PE单克隆抗体及相应对照IgG2b－FITC／IgG1－PE各10 μL，与取100 μL的PBMC混匀，在室温下避光孵育20 min，采用预冷的PBS溶液进行洗涤后，离心5 min，留取沉淀物，分别加入1 mL固定／破膜液，在4℃的温度下避光孵育30 min，以2 mL固定／破膜缓冲液洗涤2次，分别加入20 μL的相应抗体，在4℃下避光孵育30 min，再次用固定／破膜缓冲液洗涤2次，留取沉淀，采用0．5 mL PBS稀释并混匀后，采用美国BD公司生产的FACS－Calibur型流式细胞仪检测并运用CellQuest软件进行分析，检测CD4＋CD25＋Treg细胞的表达水平。③实时荧光PCR方法检测HBV－DNA水平：采用实时定量荧光PCR方法检测HBV－DNA水平，以5×105copies／L作为HBV－DNA的检测下限。同时检测各组的ALT表达水平。

1．3 统计学分析运用SPSS 17．0软件，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，相关分析采用Spearman相关分析，率的比较采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组的血清学指标表达水平比较A组的CD4＋CD25＋Treg细胞数显著低于B组和C组（P＜0．05）。A组的HBV－DNA和ALT水平均显著高于B组（P＜0．05）。见表1。

表1 各组的血清学指标表达水平比较（±s）

表1 各组的血清学指标表达水平比较（±s）

注：与C组比较，*P＜0．05；与B组比较，#P＜0．05。

nCD4+CD25+TregHBV-DNAALT组别细胞（%）（×106copies/L）（U/L）A组705．63±2．74*#10．89±1．26*#216．87±103．46*#B组869．05±4．22*6．97±0．95*165．55±87．23*C组506．75±3．17023．4±8．9

2．2 自身抗体阳性表达情况70例自身抗体表达阳性患者中，至少有1项自身抗体表达为阳性，最多者5项自身抗体均表达为阳性。其中，共42例1项抗体表达阳性，18例2项抗体表达为阳性，6例3项抗体表达阳性，2例3项抗体表达为阳性，1例4项抗体表达为阳性，1例5项表达全部为阳性。

2．3 自身抗体表达与外周血CD4+CD25+Treg细胞表达水平的相关性随着外周血CD4＋CD25＋Treg细胞百分数的增加，自身抗体数逐渐降低，经相关关系分析结果显示，二者呈显著负相关关系（r＝－0．519，P＜0．05）。见表2。

表2 不同自身抗体阳性患者CD4+CD25+Treg细胞百分数表达情况

3 讨论

慢性乙型肝炎是临床最为常见的病毒性肝炎，当机体感染乙肝病毒时，病毒可直接损害肝细胞，同时可诱发机体免疫功能紊乱，间接损害肝细胞，导致病情反复发作。目前，外周血T淋巴细胞亚群被认为是反映机体免疫功能正常与否的重要指标［3］。CD4＋CD25＋Treg细胞是20世纪70年代由免疫学家发现并提出的一种抑制性T细胞，可能在外周免疫耐受维持方面发挥重要作用。近年研究［4］发现，CD4＋CD25＋Treg细胞具有免疫抑制和免疫无能的双重特性，故又被称为调节性T细胞。有研究［5］表明，CD4＋CD25＋Treg细胞可通过TCR刺激并被活化，发挥抑制CD4＋和CD8＋T细胞活性的作用。CD4＋CD25＋Treg一旦被活化，在体外可通过CTLA－4、TGF－β及GITR等因子与相应细胞受体结合后，抑制靶细胞上IL－2Rα链的增殖与活化，从而抑制T细胞增殖；同时，在体内还可通过IL－10、IL－4及TGF－β等抑制性细胞因子发挥抑制作用。另外，当直接接触细胞时，可通过表达颗粒酶A，利用穿孔素依赖的细胞毒途径杀伤并抑制多种靶细胞的活化。近年来，有研究［6］提出CD4＋CD25＋Treg细胞可能在CHB发病过程中发挥重要作用。多数学者认为CHB患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞数量较正常人显著增多，一方面抑制了HBV特异性的CD8＋T细胞的增殖与活化，导致病毒无法得到彻底清除而发生持续感染，另一方面由于无法抑制机体过度的免疫反应，可导致肝细胞的免疫病理损伤持续存在。上述观点是基于CD4＋CD25＋调节性T细胞在自身免疫性肝炎中的作用提出的，但CHB患者与自身免疫性肝炎的发病机制存在差异，CHB患者存在自身抗体阳性和阴性两种类型，其免疫机制在发病中的作用可能也不同。

本研究比较自身抗体阳性和阴性CHB患者外周血CD4＋CD25＋Treg细胞的表达，结果显示，自身抗体阳性患者的CD4＋CD25＋Treg细胞数显著低于自身抗体阴性患者，且较正常人亦显著降低，提示自身抗体阳性乙肝患者的调节性T细胞数量及功能均偏低；同时，自身抗体阳性患者的HBV－DNA水平和ALT水平均显著高于B组，提示自身抗体阳性CHB患者的病毒复制更为活跃，肝细胞损害更重，病情更为严重。相关性分析结果显示，随着外周血CD4＋CD25＋Treg细胞百分数的增加，自身抗体数逐渐减少，二者呈显著负相关关系。提示CD4＋CD25＋Treg细胞可能具有抑制CHB患者产生自身抗体的作用，可避免机体免疫耐受的产生和发展，从而达到减轻肝炎病情的目的。

[1]曾达武,董菁,陈丽红,等．免疫清除期慢性乙型肝炎患者血清HB-sAg水平与肝组织炎症分级及纤维化分期的关系[J]．中华肝脏病杂志,2012,20(10)：746-750．

[2]王凌云,陈映波,冯炼强,等．胃癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的检测及临床意义[J]．中国免疫学杂志,2005,21(12)：59-61．

[3]严健,原永明,张舒,等．CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群在肿瘤患者外周血中检测的临床意义[J]．检验医学,2013,28(10)：901-903．

[4]王玲玲,赵明静,毛世涛,等．不同分期老年COPD患者外周血中CD4+Foxp3+调节性T细胞变化及其与肺功能改变的相关性[J]．中国老年学杂志,2012,32(2)：223-225．

[5]卞成蓉,刘佳,陈霖,等．CD4+CD25+Treg细胞对慢性丙型病毒性肝炎患者干扰素治疗疗效预判作用研究[J]．军事医学,2015 (9)：725-728．

[6]刘梦,李明慧,陈晓雪,等．Treg细胞在慢性HBV感染免疫耐受机制中的作用[J]．中华实验和临床病毒学杂志,2015,29(3)：196-198．

（责任编辑：钟婷婷）

Expression of Peripheral Blood CD4+CD25+Treg Cells in Patients with Chronic Hepatitis B and Its Relationship with Autoan-tibodies

QIU Weien,CHEN Yun,ZHOU Daoxiang,KUANG Jinbo,LIN Dan,LI Bo (Yuexiu District Hospital of TCM,Guangzhou 510030,China)

ObjectiveTo investigate the expression of CD4+CD25+Treg cells in patients with chronic viral hepatitis B(CHB)and its relationship with autoantibodies.Methods156 CHB patients treated for the first time in our hospital from January 2013 to December 2015 were divided into group A(autoantibody-positive group,70 cases)and group B(antibody-negative group,86 cases).50 cases at the same period to our hospital for normal physical examination were selected as group C.ResultsThe number of CD4+CD25+Treg cells in group A was significantly lower than that in group B and C(P＜0.05).The levels of HBV-DNA and ALT in group A were significantly higher than those in group B(P＜0.05).With the increase of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood,the number of autoantibodies decreased gradually, with a negative correlation between them(r=-0.519,P＜0.05).ConclusionsCD4+CD25+Treg cells mayinhibit the production ofautoantibodies in CHB patientsand preventthe developmentofimmune tolerance,so asto achieve the purpose ofreducingthe severityofhepatitis.

CD4+CD25+Treg cells;Hepatitis B;Autoantibody

R512．6+2

A

10．3969/j．issn．1674-4659．2017．06．0801

2017－02－07

丘卫恩（1976－），男，本科学历，主管技师，从事医学检验。