梁昌盛，李佳，陈晗，张丽芝，张杰滨，冯一苇

（中山大学基础医学实验教学中心，广东 广州 510080）

蜂胶在免疫实验教学中应用的实验研究

梁昌盛，李佳，陈晗，张丽芝，张杰滨，冯一苇

（中山大学基础医学实验教学中心，广东 广州 510080）

目的 为提高免疫实验教学质量，寻找一种安全、高效的免疫佐剂。方法选取牛血清白蛋白为抗原，制备弗氏佐剂-抗原乳化物和蜂胶-抗原混合物，分别免疫昆明种小鼠后，取小鼠血清，通过SDS-PAGE检测血清中IgG的产生情况，经间接ELISA法分析小鼠抗血清效价，观察两种不同佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答作用的差异。结果 蜂胶佐剂比弗氏佐剂免疫小鼠血清中IgG的产生时间更快、效价更高、更持久。结论 蜂胶佐剂在免疫学教学实验中的应用切实可行，有利于提高免疫实验教学质量。

蜂胶；免疫学；实验研究；教学

在我校免疫学实验教学过程中，一直使用弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）作为免疫佐剂来观测小鼠的免疫应答。此方法作为教学实验应用存在以下不足：CFA因含有卡介苗和矿物油等毒性物质，会造成动物机体局部结节和无菌性脓肿，引起伤口溃烂，严重可以导致动物死亡，从而造成学生实验无法连续；有研究［1］表明CFA可能有致癌作用，并且因其为粘稠的油性佐剂，在注射免疫动物时比较费力，经常有学生在免疫动物的时候会不小心扎到自己或同学的手部，从而导致手部发炎。为提高免疫实验教学质量，寻找一种安全、高效的免疫佐剂很有必要。

蜂胶是蜜蜂从植物中采集的树脂、花粉及蜂蜡等多种物质的混合物。有研究［2］表明蜂胶具有天然的免疫功能，本身无抗原性和过敏性，将蜂胶作为免疫佐剂，既可保持抗原特性，又可成为良好的免疫增强剂和促进剂，有促进抗体产生的功能。

本实验通过以牛血清白蛋白（BSA）为抗原，观察CFA和蜂胶两种不同佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答作用的差异，探讨蜂胶在免疫学教学实验中的应用价值，为其在免疫学教学实验中的应用可行性提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物6周龄SPF级昆明种小鼠，体重18～22 g，雌性，由中山大学实验动物中心提供。

1．2 试剂及设备水溶性纯蜂胶，纯度＞90%，为杰禾蜂业有限公司产品；CFA，由本实验室制备；0．01M PBS，无菌超净水，PBS－T等。冷冻离心机（Sigma），洗板机（Biotek ELX50），酶标仪（TECAN Sunrise）。

1．3 免疫抗原的制备快速称取一定量的水溶性纯蜂胶，溶于无菌超净水中，制成40 mg／mL的蜂胶佐剂。取40 mg／mL的蜂胶0．5 mL加2 mg／mL牛血清白蛋白（BSA）0．5 mL，充分混匀，制备成蜂胶－BSA混合物。将液体石腊油和无水羊毛脂按3∶1比例制成不完全弗氏佐剂，在此基础上加入灭活的卡介苗（终浓度为5 mg／mL）即为完全弗氏佐剂（CFA）。取CFA 0．5 mL加2 mg／mL牛血清白蛋白（BSA）0．5 mL，用电动搅拌法乳化，制备成CFA－BSA乳化物。

1．4 动物分组及免疫注射将昆明小鼠分成正常对照组、蜂胶－BSA组、CFA－BSA组三组，每组20只。蜂胶－BSA组、CFABSA组分别皮下注射蜂胶－BSA和CFA－BSA 0．1 mL，使两组的BSA注射量均为100 μg［3］。正常对照组皮下注射生理盐水0．1 mL。并于第7天及第14天进行加强免疫。注射后7、14、21、28天，各组分别眼球采血处死小鼠5只进行试验。

1．5 检测指标

1．5．1 ELISA法分析小鼠抗血清效价使用标准96孔酶标板，BSA 1 μg／孔进行包被。封闭后加入1∶100稀释的小鼠血清100 μL，免疫后7天小鼠血清对倍稀释到第十孔，其余时间的小鼠血清对倍稀释到第二十孔，并做阳性、阴性血清对照。置37℃孵育1 h。经彻底洗涤后，加辣根过氧化酶（HRP）标记的酶标羊抗小鼠IgG（1∶1 000稀释）100 μL。37℃孵育45 min。最后加100 μL底物TMB，避光室温孵育至阳性孔显色，加入终止液2 mol／L H2SO4终止反应。经酶标仪于490 nm波长处测定OD值。

1．5．2 SDS-PAGE检测血清中IgG免疫后7天、14天取小鼠血清分别作25倍稀释后，以还原型处理液处理，上样量20 μL。按照Laemmli体系，浓缩胶5%，分离胶12%，电压120 V，时间2 h，硝酸银染色。

2 结果

2．1 ELISA法检测小鼠抗血清效价结果小鼠血清效价的确定，根据中华人民共和国国家标准中，《实验动物－酶联免疫吸附试验》要求判定阴性和阳性血清，以阳性血清A490大于阴性对照平均值2．1倍时的最低稀释度为ELISA效价。实验统计结果显示，蜂胶－BSA组各时间点的小鼠抗血清效价均高于CFABSA组；蜂胶－BSA组免疫后7天抗血清效价为1∶6 400，比CFA－BSA组免疫后7天抗血清效价1∶1 600高4倍，表明蜂胶－BSA组产生IgG的量更多；见表1。

表1 小鼠免疫血清抗体效价结果（n＝5，±s）

表1 小鼠免疫血清抗体效价结果（n＝5，±s）

组别蜂胶-BSA组CFA-BSA组P 7天1∶（6400±3200）1∶（1600±800）＜0．05 14天1∶（409600±204800）1∶（102400±51200）＜0．05 21天1∶（1638400±81920）1∶（819200±409600）＜0．05 28天1∶（819200±409600）1∶（204800±102400）＜0．05

2．2 SDS-PAGE检测血清中IgG结果IgG（150 kDa）经巯基乙醇分解后产生重链（50 kDa）和轻链（25 kDa），如图1所示。正常对照组血清（5条带）在50 kDa和25 kDa处没有出现明显的条带；而免疫后7天、14天的小鼠血清均出现明显的条带，说明蜂胶－BSA、CFA－BSA两组小鼠免疫后7天血清中均产生一定量的IgG，且蜂胶－BSA组小鼠免疫后7天血清中的IgG含量高于CFA－BSA组，这与ELISA法检测小鼠抗血清效价结果相符。

3 讨论

国外著名科学家杜尼耶文通过实验证明：蜂胶能增加白细胞的吞噬活性，使机体血清总蛋白和球蛋白合成量增加，并使免疫出现早且持续时间长［4］；柴家前等［5］证实，将蜂胶配合抗原引入机体，能增加抗体产生，还能对胸腺、脾脏及整个免疫系统产生有益的影响，引起强烈的浆细胞反应并刺激局部和远区淋巴结的抗体产生，并可通过激活巨噬细胞而增强免疫应答，显著增强机体免疫功能。本实验中，ELISA法检测小鼠抗血清效价结果表明，将蜂胶配合抗原引入机体，能产生大量的抗体，蜂胶－BSA组免疫后7、28天的抗血清效价比CFA－BSA组高4倍，且ELISA、SDS－PAGE检验结果相互一致，和上述文献中的实验结果相符，蜂胶能使免疫出现早且持续时间长。

图1 小鼠血清SDS-PAGE银盐染色结果

蜂胶作为免疫佐剂已广泛用于制造多种兽用疫苗，并因其不影响抗原的抗原性，保护率高，接种后无不良反应，其中禽霍乱蜂胶疫苗在我国已试用推广到全国30多个省市区［6－7］。现在国内大多数医学院校在免疫学实验教学过程中，都会使用CFA作为免疫佐剂来观测小鼠的免疫应答，未见蜂胶作为免疫佐剂在免疫学实验教学应用的有关文献报道。本实验结果表明，蜂胶配合抗原注入小鼠体内，注射部位无肿胀、无坏死、无脓肿，机体能快速产生抗体。蜂胶溶液是水性溶液，和抗原只要简单混合均匀，不要特殊方法处理，并且注射方便。与传统CFA油性佐剂相比更安全、抗体效价更高、更持久，并且资源丰富、价格低廉。因此，蜂胶佐剂在免疫学教学实验中的应用切实可行，有利于提高免疫实验教学质量，值得推广。

[1]李渊,孙红祥．不同类型免疫佐剂的作用比较[J]．浙江畜牧兽医, 2003,28(5)：16-18．

[2]刘杉,刘云志,杨金生,等．免疫佐剂的研究进展[J]．吉林畜牧兽医,2011,32(8)：46-47．

[3]周俊宜．分子医学技能[M]．北京：科学出版社,2006：232-233．

[4]裴志花,王开．蜂胶佐剂在畜禽疫苗中的应用[J]．吉林畜牧兽医, 2007,28(1)：21-22．

[5]柴家前,王玲,庞昕,等．纳米蜂胶颗粒对鸡免疫功能的影响[J]．畜牧兽医学报,2002,33(4)：412-416．

[6]向会耀,谭玉梅,向雅倩,等．蜂胶佐剂对E.coli多价灭活苗免疫小鼠效果的实验研究[J]．细胞与分子免疫学杂志,2008,24(5)：535-536．

[7]高泽乾,孙建男,武炜,等．兽用免疫佐剂的研究进展[J]．唐山师范学院学报,2012,34(2)：45-48．

（责任编辑：常海庆）

Experimental Study on the Application of Propolis in the Experiment Teaching of Immunology

LIANG Changsheng,LI Jia,CHEN Han,ZHANG Lizhi,ZHANG Jiebin,FENG Yiwei
(Experimental Center for Basic Medical Teaching,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China)

ObjectiveTo find a safe and effective immune adjuvant in order to improve the teaching quality of immune experiment.MethodsUsing bovine serum albumin as antigen,complete Freund's adjuvant-antigen emulsification and propolis-antigen mixture were prepared to immunize Kunming mice.Later,the serum of mice were collected to detect the production of IgG by SDS-PAGE,and analyze theserumantibodytiterofmice.Thedifferencebetweentwokindsofadjuvantintheeffectininducingimmuneresponseofmicewereobserved.ResultsThe propolis adjuvant had faster production time,higher titer and longer duration than Freund's adjuvant.ConclusionsThe propolis adjuvant is feasible applied in immune experiment in teaching,and helpful to improve the teaching quality of immune experiment.

Propolis;Immunology;Experimental study;Teaching

R392-33

A

10．3969/j．issn．1674-4659．2017．06．0765

2017－01－17

2017－04－07

中山大学实验室开放基金项目（项目编号：KF201242）

梁昌盛（1976－），男，广东肇庆人，大学本科学历，从事医学实验教学研究和管理工作，E－mail：lchangsh＠mail．sysu．edu．cn。