方子妍，郭彩凤，吴逢春，秦家明，宁玉萍*，周列民*

（1广州医科大学附属脑科医院／广州市惠爱医院神经科，广东 广州 510370；

2中山大学附属第一医院神经科，广东 广州 510080）

Tariquidar提高苯妥英钠在颞叶内侧癫痫模型鼠脑中的分布

方子妍1，郭彩凤1，吴逢春1，秦家明2，宁玉萍1*，周列民2*

（1广州医科大学附属脑科医院／广州市惠爱医院神经科，广东 广州 510370；

2中山大学附属第一医院神经科，广东 广州 510080）

目的 观察tariquidar（TQD）能否避开颞叶内侧癫痫（MTLE）模型鼠P糖蛋白（Pgp）过表达的外排作用将抗癫痫药物输送至脑。方法锂-匹罗卡品诱导构建MTLE大鼠模型，并将模型鼠分成两组，分别予苯妥英钠（PHT）及PHT+TQD治疗，观察两组大鼠脑中PHT分布。活体微透析采集脑微透析液，高效液相色谱法检测PHT浓度。免疫组化检测Pgp表达。运用t检验或Wilcoxon秩和检验进行统计学分析。结果 模型鼠海马区Pgp表达上调（P＜0．05）。两组模型鼠的脑／血浆的时间药物浓度曲线的曲线下面积比值有显著性差异［PHT+TQD组（0．31±0．06）＞PHT组（0．19±0．06），P＜0．05］。结论 TQD可显著提高PHT在Pgp过表达MTLE模型鼠脑中的分布。

颞叶内侧癫痫；匹罗卡品；P糖蛋白；TQD；耐药性癫痫

癫痫是中枢神经系统常见病。尽管近年来在治疗方法上已取得了进展，但合理、规则地服用抗癫痫药物（antiepileptic drugs，AEDs）仍是目前治疗癫痫的主要手段。然而约30%的患者虽经规范合理的AEDs治疗，发作仍无法控制，即耐药性癫痫［1－3］。临床上耐药性癫痫以颞叶内侧癫痫（mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）尤为多见。

虽然药物耐受的病理生理机制存在多种假说，但耐药性癫痫的一个重要特性是对多种AEDs耐药，即使这些AEDs具有不同的作用机制［4］。这一现象是其他假说所无法解释的，而更多地指向多药转运体过度表达假说。研究发现耐药性癫痫患者手术切除的脑组织上Pgp过表达。而几乎所有的AEDs都是Pgp的底物。除此之外，动物实验也证实血脑屏障上Pgp过表达导致了药物耐受［5］。因此如何抑制或逆转Pgp过度表达，增加AEDs靶向进入癫痫灶是治疗耐药性癫痫的一个可行方法，是目前耐药性癫痫研究的焦点。

近来，Pgp拮抗剂的研发多局限于肿瘤领域，最初的Pgp第一代拮抗剂缺乏特异性，带来很多严重的副作用。因此，针对Pgp拮抗剂特异性开发了一些新的药物，其中以Pgp第三代拮抗剂TQD为代表。Ⅲ期临床试验证明TQD能提高伴Pgp过表达的肿瘤对一些化疗药物的敏感性［6］。而在癫痫领域，仅见Brandt等［7］的研究结果证实苯巴比妥联合应用TQD能明显减少伴Pgp过表达的苯巴比妥耐药癫痫大鼠的发作次数。

尽管得出上述结论，但仍缺乏直接评估联合TQD后对AEDs药代动力学影响的证据。因此，本研究拟观察TQD能否提高MTLE模型鼠脑中PHT浓度，为TQD逆转癫痫耐药提供直接药代动力学证据。

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．1．1 动物来源雌性6～8 w SD大鼠，体重160～180 g，由广东省实验动物研究所提供。

1．1．2 主要试剂氯化锂（Sigma）；匹罗卡品（Sigma）；东莨菪碱（Sigma）；苯妥英钠（Sigma）；单克隆小鼠抗大鼠Mdr C－19（sc－1517，Santa Cruz Biotechnology，USA）；tariquidar（Medkoo Biosciences，Inc．）。

1．1．3 主要仪器设备微量进样泵（MD－1020，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微量收集器（MD－1027，Bioanalytical Systems Inc，USA）；微透析用管路（ID 0．12 mm，OD 0．65 mm，Carnegie Medicine，Sweden）；微透析探针（CMA／12，3 mm，20 kD，Carnegie Medicine，Sweden）。

1．2 MTLE模型鼠构建及脑组织Pgp表达检测

1．2．1 MTLE模型鼠构建步骤腹腔注射氯化锂（127．2 mg／kg，63．6 mg／mL）；18～24 h后腹腔注射东莨菪碱（1 mg／kg，0．5 mg／mL）；之后30 min，腹腔注射匹罗卡品（30 mg／kg，15 mg／mL）；当大鼠出现RacineⅣ／Ⅴ发作持续90 min后腹腔注射地西泮注射液（10 mg／kg，5 mg／mL）终止发作。记录发作期及发作间期的相关资料。

1．2．2 发作评估方法观察并记录大鼠急性期及慢性期发作的情况，按Racine标准［8］进行分级。

1．2．3 大鼠脑组织中Pgp表达的检测具体参见前期工作［9］。

1．3 TQD应用于MTLE模型鼠的药代动力学改变

1．3．1 活体微透析检测大鼠脑中PHT浓度

1．3．1．1 微透析探针局部立体定位前囟后5．2 mm，左侧5．0 mm，深度为前囟下7．5 mm（腹侧海马）［10］。

1．3．1．2 微透析步骤探针稳定2 h后给药，PHT组（n＝6）及PHT＋TQD组（n＝5）分别一次性静脉给PHT 35 mg／kg、PHT（35 mg／kg）＋TQD（PHT给药前30分钟静脉给予TQD 15 mg／kg）。分别于给药后30 min、60 min、120 min、180 min、240 min和300 min取血。收集相应时间段的微透析液。微透析实验后心脏灌注，断头取脑，多聚甲醛固定，蔗糖脱水，OCT胶包埋，海马冠状切片（10 μm）。

1．3．2 高效液相色谱法检测PHT浓度具体参见前期工作［10］。

1．4 统计学处理

2 结果

2．1 MTLE模型鼠脑中Pgp表达

MTLE模型鼠在海马CA1、CA3及DG区上均有Pgp的表达，较正常大鼠脑组织中Pgp的表达明显上调（P＜0．05），见图1。

图1 MTLE模型鼠及正常大鼠的海马组织DG、CA1及CA3区中Pgp的表达情况

图示为免疫组化图片显示模型鼠与正常鼠海马区（高倍镜×400）Pgp的表达情况。棕褐色颗粒染色面积反映各组海马区Pgp的表达程度，两组之间均有显著性差异（P＜0．05）。图中A、B、C为MTLE模型鼠，而E、F、G为正常大鼠。

2．2 TQD应用于MTLE模型鼠的药代动力学改变

2．2．1 脑微透析液PHT浓度给药后60 min，两组在该时间点均为检测的最高药物浓度，之后逐渐下降，两组PHT浓度上升及下降速率一致。两组在30 min、60 min、120 min和180 min其脑微透析液中药物浓度差异均有统计学意义（P＜0．05）；但在给药后240 min和300 min，PHT＋TQD组略高于PHT组，差异无统计学意义（P＞0．05）。见表1。

2．2．2 血浆中PHT浓度给药后30 min，两组在该时间点均为检测的最高浓度，之后逐渐下降，但PHT＋TQD组较PHT组药物浓度下降速度较迅速。两组在30 min、60 min、120 min和240 min其外周血中药物浓度差异均无统计学意义（P＞0．05）；但在180 min及300 min时间段，PHT＋TQD组血浆中药物浓度比PHT组低，组间差异有统计学意义（P＜0．05）。见表1。

表1 两组模型鼠不同时间点的脑微透析液和血浆药物浓度比较（±s）

表1 两组模型鼠不同时间点的脑微透析液和血浆药物浓度比较（±s）

注：与PHT+TQD组比较，*P<0.05，差异具有统计学意义。

脑微透析液PHT浓度（μg/mL）血浆PHT浓度（μg/mL）时间PHT+TQD组PHT组PHT+TQDPHT组组30min3.63±0.952.26±0.39*19.33±2.5019.21±2.04 60min4.58±1.043.03±0.67*16.61±2.7615.78±2.42 120min4.13±0.852.75±0.74*11.29±2.4113.27±1.61 180min3.51±0.782.42±0.72*9.08±2.5212.15±1.39*240min3.18±0.862.21±0.658.57±2.0710.81±2.10 300min2.74±0.631.94±0.607.33±2.6910.56±1.85*

2．2．3 脑中PHT分布两组模型鼠的脑／血浆的时间药物浓度曲线的AUC比值之间有显著性差异（P＜0．05），即药物在脑内的分布高低情况为PHT＋TQD组＞PHT组（图2）。

3 讨论

多药转运体过表达学说在耐药性癫痫的形成中具有重要意义。本研究在MTLE（常见的耐药性癫痫类型）模型鼠脑中检测到多药转运体蛋白（Pgp）过表达，当给予Pgp抑制剂TQD时能显著增加AEDs在模型鼠脑中的分布。

图2 脑／血浆的时间药物浓度曲线的AUC比值的比较

图示为两组模型鼠的脑／血浆的时间药物浓度曲线的AUC比值，两组之间具有显著性差异（P＜0．05），即PHT＋TQD组（0．31±0．06）＞PHT组（0．19±0．06）。

耐药性癫痫出现药物耐受是由于中枢神经系统中多药转运体如Pgp过度表达，减少了Pgp底物如AEDs在癫痫灶的浓度，导致耐药出现。1995年Tishler等［11］首先证实耐药性癫痫患者脑内Pgp表达显著高于正常人脑组织。之后的研究也发现，在耐药性癫痫患者病灶处可见Pgp过表达，并伴有脑内AEDs浓度下降［12］。本研究已证实MTLE模型鼠海马椎体细胞层的神经元上Pgp表达增高。除此之外，Volk和Loscher提出杏仁核电点燃模型鼠中，苯巴比妥耐药模型鼠的脑中Pgp表达水平也高于苯巴比妥反应组［5］。这些研究结果均证实耐药与脑中Pgp表达增高有关［13］。由此推测由于癫痫发作导致Pgp过表达，增强药物主动外向转运，使到达致痫灶的药物浓度不足，导致癫痫发作不能控制。频繁的癫痫发作将导致Pgp的持续过度表达，从而形成一个恶性循环，最终导致耐药性癫痫形成。

而本研究结果证实TQD可提高耐药模型鼠脑中PHT浓度，该结果进一步反面支持多药转运体与癫痫耐药的密切关系。TQD是目前所知的最有效的、高选择性的Pgp第三代拮抗剂。多项研究发现TQD可提高多种耐药细胞系对药物的敏感性，支持TQD具有逆转Pgp过表达导致的耐药作用［14－15］。有研究记录大鼠维拉帕米（VPM是Pgp的底物）给药前和给药后合并使用TQD 15 mg／kg的PET图像，结果TQD增加约12倍的VPM体积分布［16］。此外，研究者van Vliet等［17］报道合并使用12或24 mg／kg的TQD能显著提高PHT的抗癫痫效果。因此，15 mg／kg的TQD剂量作为本研究的实验剂量是由早期对耐药性动物模型鼠的研究证实的，而更高剂量的TQD剂量未能对抗癫痫药物的治疗产生更好的效用，反而会增加其副作用［7］。尽管本研究采用活体微透析技术证实了TQD提高AEDs在脑中的分布，甚至在给药120 min后，当PHT＋TQD组血中PHT浓度低于PHT组时，PHT＋TQD组脑中PHT浓度仍明显高于PHT组，但TQD是否影响其他脏器AEDs浓度水平并不清楚，因此可以进一步在本研究基础上观察TQD在增加脑中PHT浓度的同时在其他脏器的药物浓度来观察其毒副作用，提供TQD治疗耐药性癫痫更为详细、全面的理论基础。

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（责任编辑：常海庆）

Effects of Tariquidar for Targeting Phenytoin into the Brain of MTLE Rat Model

FANG Ziyan1,GUO Caifeng1,WU Fengchun1,QIN Jiaming2,NING Yuping1*,ZHOU Liemin2*
(1Department of Neurology,the Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University/Guangzhou Huiai Hospital,Guangzhou 510370,China;2Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China;*

s:NING Yuping,E-mail:ningjeny@126.com;ZHOU Liemin,E-mail:lmzhou56@163.com)

ObjectiveIn order to evaluate that whether TQD has the ability of targeting of antiepileptic drug phenytoin into the brain with overexpression of Pgp in a model of mesial temporal lobe epilepsy(MTLE)rat.MethodsThe rats model of mesial temporal lobe epilepsy(MTLE)were induced bylithium-pilocarpine,which were divided into two groups with PHT and PHT+TQD treatment,respectively. Dialysate samples were collected by microdialysis technology,and the analysis of samples was performed by high performance liquid chromatography(HPLC).Immunohistochemistry assay was performed for Pgp expression at the hippocampus.The comparisons were carried out by t-test or Wilcoxon test.ResultsThe Pgp immunopositive area was significantly higher in the hippocampus of MTLE rats when compared to the normal rats(P＜0.05).The significantly increased area under the curve(AUC)ratio of brain/plasma in PHT+TQD drug group was 0.31±0.06,when compared with PHT drug group(0.19±0.06),P＜0.05.ConclusionsTQD can significantly distribute PHT into brain with overexpressed Pgp in MTLE rat model.

MTLE;Pilocarpine;P-glycoprotein;Tariquidar;Drug-resistant epilepsy

R-332；R742．1

A

10．3969/j．issn．1674-4659．2017．06．0762

2016－12－23

2017－03－24

国家自然科学基金面上项目（81071050；81571333）；广州市医药卫生科技项目（20171A011268；20161A011036）；广州市科技计划科技型中小企业创新－初创项目（2017010160496）；广州市脑科医院广州市医学重点学科建设项目子项目（GBH2014－QN03）

方子妍（1985－），女，江西南昌人，博士学位，主治医师，主要从事癫痫等神经系统疾病的研究。

*通讯作者：宁玉萍，E－mail：ningjeny＠126．com；周列民，E－mail：lmzhou56＠163．com。