边 可，雷 微，熊 琦，徐小容，陈 华，吴 璇，陈永艳

(1.杭州市第三人民医院 皮肤科，浙江 杭州 310009；2.遵义医学院附属医院 皮肤科，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院珠海校区2012级临床医学系，广东 珠海 519041)



临床医学研究

转录因子T-bet/GATA-3在早期潜伏梅毒患者外周血单个核细胞中的表达

边 可1，雷 微2，熊 琦2，徐小容2，陈 华2，吴 璇3，陈永艳2

(1.杭州市第三人民医院 皮肤科，浙江 杭州 310009；2.遵义医学院附属医院 皮肤科，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院珠海校区2012级临床医学系，广东 珠海 519041)

目的 探讨转录因子T-bet/GATA-3在早期潜伏梅毒免疫发病机制中的作用。方法 应用实时荧光定量PCR检测20例早期潜伏梅毒患者、20例早期显性梅毒患者和25例正常对照者外周血单个核细胞中T-bet和GATA-3 mRNA的相对表达量。结果 ①潜伏梅毒组T-bet mRNA相对表达量显著低于正常对照组、显性梅毒组，差异有统计学意义(P均<0.05)，显性梅毒组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；②潜伏梅毒组、显性梅毒组、正常对照组之间GATA-3 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。③潜伏梅毒组T-bet/GATA-3比值显著低于正常对照组、显性梅毒组，差异有统计学意义(P均<0.05)，显性梅毒组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；④T-bet、GATA-3 mRNA相对表达量与血清RPR滴度之间无相关性(rs=0.19,rs=0.10,P均>0.05)。结论 T-bet/GATA-3表达失衡可能在早期潜伏梅毒免疫发病机制中具有重要作用，主要与转录因子T-bet低表达有关。

潜伏梅毒；外周血单个核细胞；T-bet；GATA-3

近年来，我国梅毒报告发病率呈快速增长趋势，且以潜伏梅毒增幅最大[1]，已成为临床医务人员在工作中不容忽视的问题。梅毒的发病涉及复杂的免疫学变化，至今尚未完全阐明。已有的研究表明Th1/Th2细胞在梅毒免疫过程中发挥重要作用，而Th1/Th2细胞的分化及免疫应答功能与其表达的特异性转录因子密切相关。关于Th1/Th2特异性转录因子T-bet/GATA-3在早期潜伏梅毒免疫发病机制中的作用，目前国内外鲜见报道。本研究采用实时荧光定量PCR检测早期潜伏梅毒患者外周血单个核细胞中Th1/Th2特异性转录因子T-bet和GATA-3 mRNA的相对表达量，在转录因子水平探讨其在早期潜伏梅毒免疫发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年3月至12月在遵义医学院附属医院皮肤性病门诊经梅毒血清学检测确诊的梅毒患者。潜伏梅毒组20例，男10例，女10例，年龄20～52岁，平均(34.00±11.35)岁，RPR滴度1：1～1：16，未接受过驱梅治疗，病程均在2年以内，并经脑脊液血清学检查排除神经梅毒。显性梅毒组20例，男11例，女9例，年龄16～45岁，平均(31.70±8.67)岁，RPR滴度1：4～1：128，病程均在2年以内。正常对照组为健康献血者共25例，男11例，女14例，年龄20～53岁，平均(30.12±8.15)岁，血清RPR及TPPA试验均为阴性。排除标准：近期有不洁性行为者、患有其他性传播疾病、自身免疫性疾病、合并其他感染性疾病及恶性肿瘤等。

1.2 主要实验仪器和试剂 CFX96TM荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)、人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)、TRIzol® Reagent(美国Invitrogen公司)、逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)、紫外/可见光分光光度计(德国Eppendorf公司)、水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

1.3 实验方法 用EDTA抗凝管采集外周静脉血5 mL，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。Trizol法提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测得RNA样品的浓度及纯度。按试剂盒说明书逆转录合成cDNA，并以此模板进行Real-time PCR扩增。Real-time PCR特异性引物均由宝生物工程(大连)有限公司设计并合成。T-bet：上游：5'-TGGTCCAAGTTTAATCAGCACCAG-3'，下游：5'-CCCGGCCACAGTAAATGACAG-3'；GATA-3：上游：5'-CCTCATTAAGCCCAAGCGAAG-3'，下游：5'-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3'。β-actin：上游：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。反应结束后应用系统软件绘制扩增曲线、熔解曲线，采用2-△△Ct法计算相对表达量，△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因。

2 结果

2.1 T-bet和GATA-3 mRNA的表达水平(见表1，图1～9) 经单因素方差分析发现：①潜伏梅毒组、显性梅毒组、正常对照组之间T-bet mRNA相对表达量差异具有统计学意义(F=5.61,P<0.05)；进一步两两比较，潜伏梅毒组T-bet mRNA表达水平显著低于正常对照组、显性梅毒组，差异有统计学意义(P均≤0.05)，显性梅毒组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；②潜伏梅毒组、显性梅毒组、正常对照组之间GATA-3 mRNA相对表达量差异无统计学意义(F=1.08,P>0.05)；③潜伏梅毒组、显性梅毒组、正常对照组之间T-bet/GATA-3比值差异具有统计学意义(F=4.29,P≤0.05)；进一步两两比较，潜伏梅毒组T-bet/GATA-3比值显著低于正常对照组、显性梅毒组，差异有统计学意义(P均<0.05)，显性梅毒组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

组别例数T-betGATA-3T-bet/GATA-3正常对照251.03±0.341.06±0.401.02±0.26显性梅毒200.96±0.320.95±0.411.08±0.31潜伏梅毒200.73±0.22▲#0.90±0.260.84±0.23▲#F5.611.084.29P0.000.350.02

▲与正常对照组比较P<0.05;#与显性梅毒组比较P<0.05。

2.2 T-bet和GATA-3 mRNA表达水平与血清RPR滴度之间的相关性分析 经Spearman相关分析，T-bet 和GATA-3 mRNA表达水平与血清RPR滴度之间不存在相关性(rs=0.19,P>0.05;rs=0.10,P>0.05)。

3 讨论

梅毒是一种严重威胁全球公共健康的性传播疾病，梅毒的盛行使成人发病率和新生儿死亡率升高[2]，并可导致严重的并发症。T细胞免疫是机体清除梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,TP)的主要方式，已有的研究表明梅毒患者体内Th1/Th2平衡失调是造成其病程迁延同时也是潜伏梅毒和血清固定形成的重要原因。Th1/Th2极化受诸多因素的影响，目前已有的研究主要通过检测血清中细胞因子的种类和浓度来判断梅毒患者的免疫状态[3-4]。学者们希望可以从Th1/Th2细胞分化的上游进行控制干预，以寻找影响Th1/Th2极化失衡的原因。

转录因子T-bet和GATA-3分别作为Th1/Th2细胞分化过程中作用相反的两个关键性转录因子[5-6]，因其能够相互调节二者分化并参与多种疾病的发生、发展而广泛受到关注，而有关T-bet、GATA-3与早期潜伏梅毒发病之间的关系尚未见报道。转录因子T-bet选择性地表达于Th1细胞，通过激活Th1特征性细胞因子IFN-γ基因控制其表达，并与之形成正反馈调节机制从而促进初始Th细胞向Th1细胞分化；此外，T-bet还可在Th1细胞分化过程中抑制GATA-3的表达，从而阻止Th细胞向Th2细胞分化。转录因子GATA-3能调控Th2细胞分化及Th2型细胞因子IL-4等的产生，IL-4又能够直接激活STAT6并活化GATA-3，当GATA-3的表达量达到一定水平后与IL-4形成一个不依赖于STAT6的正反馈环路，进一步上调自身的表达来维持Th2细胞分化[7]。此外还可通过抑制IFN-γ的表达使Th1细胞分化受抑制，并促进Th2细胞的发展。因此，笔者推测T-bet和GATA-3的表达失衡可能在潜伏梅毒发病中起重要作用。本实验结果显示，潜伏梅毒组T-bet mRNA相对表达量显著低于正常对照组和显性梅毒组，差异有统计学意义，显性梅毒组与正常对照组比较差异无统计学意义；潜伏梅毒组、显性梅毒组、正常对照组之间GATA-3 mRNA相对表达量差异无统计学意义。笔者初步推断，潜伏梅毒患者外周血中的T-bet mRNA表达降低，使其对Th1的极化作用降低，导致IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子分泌减少，并削弱了T细胞的功能，降低了机体对TP的清除能力；另一方面促进了Th2细胞亚群的分化，导致IFN-γ的表达受抑制从而抑制了Th1细胞的分化，使TP能够逃避机体的免疫监视，在无临床症状或临床症状已消失的情况下TP仍能在梅毒患者体内长期潜伏，使机体进入无症状的潜伏阶段。

现有研究认为T-bet/GATA-3的比值较单一检测T-bet或GATA-3的水平能够更加客观地反映出Th1/Th2分化情况[8]，可作为衡量Th1/Th2平衡的新指标。本研究发现：潜伏梅毒组T-bet/GATA-3比值显著低于正常对照组和显性梅毒组，差异有统计学意义，显性梅毒组与正常对照组比较差异无统计学意义。根据以往文献资料及以上研究结果提示，潜伏梅毒患者外周血存在Th1/Th2失衡，不仅体现在细胞水平、细胞因子水平，还表现在转录因子水平。随着病程进入梅毒的无症状潜伏阶段，T-bet/GATA-3出现平衡失调，且主要与T-bet mRNA的相对表达量降低有关，而GATA-3的作用相对较弱，这可能在Th1/Th2极化失衡中起到重要作用，从而抑制机体对TP的免疫应答，不能有效清除TP。实验结果还表明T-bet和GATA-3 mRNA表达水平与血清RPR滴度之间不存在相关性。

总之，早期潜伏梅毒患者存在T-bet/GATA-3表达失衡并且可能在梅毒免疫发病机制中起重要作用。二者还与其他转录因子共同调控着复杂的细胞因子网络，通过动态调节决定T细胞最终分化方向[9]。由于转录因子、细胞因子众多且相互影响，至于T-bet、GATA-3如何与其他转录因子一起在潜伏梅毒患者体内动态调节T细胞的分化还有待进一步研究。

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[收稿2017-03-23;修回2017-04-20]

(编辑：王福军)

Research on the expression of transcription factors T-bet/GATA-3 in peripheral blood mononuclear cells from patients with early latent syphilis

BianKe1,LeiWei2,Xiongqi2,XuXiaorong2,ChenHua2,WuXuan3,ChenYongyan2

(1.Department of Dermatology,The Third People’s Hospital of Hangzhou,Hangzhou Zhejiang 310009,China;2.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;3.Department of 2012 Chinical Medical,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China )

Objective To investigate the role of transcription factors T-bet/GATA-3 in the immunological pathogenesis of patients with early latent syphilis.Methods The expression levels of T-bet mRNA and GATA-3 mRNA was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction in the peripheral blood from 20 early latent syphilis patients,20 early symptomatic syphilis patients and 25 healthy controls.Results 1)The expression level of T-bet mRNA in latent syphilis group was significantly lower than that in symptomatic syphilis group and control group(P<0.05),and there was no difference between symptomatic syphilis group and control group(P>0.05).2)No difference of the expression level of GATA-3 mRNA was found among latent syphilis group,symptomatic syphilis group and control group(P>0.05).3)The ratio of T-bet/GATA-3 in latent syphilis group was significantly lower than those in symptomatic syphilis group and control group(P<0.05).There was no difference between symptomatic syphilis group and control group(P>0.05).4)Spearman correlation analysis suggested that there was no association between the expression level of T-bet mRNA or GATA-3 mRNA and serum RPR titre(rs=0.19,P>0.05;rs=0.10,P>0.05).Conclusion The imbalance of T-bet/GATA-3 may play an important role in the immunological pathogenesis of early latent syphilis,especially the low expression of T-bet might be involved in the imbalance of T-bet/GATA-3.

latent syphilis；peripheral blood mononuclear cell；T-bet；GATA-3

贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J字[2010]2157)。

陈永艳，女，主任医师，硕士生导师，研究方向：皮肤分子生物学，E-mail:cyyzy@126.com。

R759.1

A

1000-2715(2017)03-0285-04