杨少玲，朱旅云，胡丽叶，刘 洋，武 珊

创面负压治疗对糖尿病足不同缺血创面肉芽组织EDA+FN的影响

杨少玲，朱旅云，胡丽叶，刘 洋，武 珊

目的 探讨创面负压治疗(negative pressure wound therapy， NPWT)对糖尿病足不同缺血创面肉芽组织EDA+FN的影响。方法 选取我院2014年1月—2016年1月符合入组标准的糖尿病足30例，依据踝肱比值(ABI)，分为0.5≤ABI<0.7组和0.7≤ABI≤0.9组，每组各15例。两组均予NPWT，并于治疗前及治疗第14天取创面肉芽组织，观察EDA+FN的变化。结果 与本组治疗前比较，两组治疗后EDA+FN面密度值、EDA+FN相对蛋白表达量及EDA+FN相对mRNA表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；治疗后0.7≤ABI≤0.9组EDA+FN面密度值、EDA+FN相对蛋白表达量及EDA+FN相对mRNA表达量较0.5≤ABI<0.7组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 NPWT对糖尿病足不同缺血创面EDA+FN的影响不同，随着缺血程度的加重，创面肉芽组织EDA+FN的表达下降。

糖尿病足；创面负压治疗；肉芽组织

糖尿病足是糖尿病严重的慢性并发症之一，致残率高、花费高、病程长，给患者、家庭、甚至社会带来了沉重的经济和心理负担[1-4]。糖尿病足创面是由周围血管及神经病变、感染等因素引起，常表现为慢性创面，迁延不愈，故如何促进糖尿病足创面的愈合是临床急需解决的问题。创面负压治疗(negative pressure wound therapy， NPWT)是近年开展的一种新型治疗方法。有研究显示，NPWT可促进糖尿病足创面的愈合[5-6]。然而，临床实践发现NPWT对不同缺血创面的治疗效果有所不同，其对轻中度缺血创面的治疗效果较好，对重度缺血创面则效果欠佳，相关作用机制有待于进一步研究。

纤维连接蛋白(FN)分为血浆型纤维连接蛋白(pFN)和细胞型纤维连接蛋白(cFN)，其中cFN是细胞外基质的主要组成之一，而EDA+FN(spliced extra domain A fibronectin)为cFN，其较pFN在创面愈合过程中起着更为重要的作用，其可促进细胞黏附和迁移，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，是促进创面愈合的重要因素之一[7-8]。为探讨NPWT对糖尿病足不同缺血创面EDA+FN的影响，本研究以糖尿病足为研究对象，观察NPWT对不同踝肱比值(ABI)糖尿病足创面肉芽组织EDA+FN的影响,探讨NPWT对不同缺血糖尿病足创面产生不同治疗效果的影响因素，为NPWT在糖尿病足创面的治疗选择上提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取 2014年1月—2016年1月在我院住院的糖尿病足30例，按照ABI将其分为0.7≤ABI≤0.9组和0.5≤ABI<0.7组，每组各15例。纳入标准[9]：①有1个月以上的难以愈合的慢性糖尿病足溃疡；②年龄50～70岁；③ABI为0.5～0.9；④Wagner分级2～4级；⑤创面局部感染得到有效控制；⑥无明显的坏死组织及脓性分泌物。排除标准[10]：①未经治疗的蜂窝织炎、有明显大块坏死组织或严重的骨髓炎；②恶性创面；③于研究前30 d内或研究期间接受生长因子或高压氧治疗；④合并严重肝肾功能损害、血液系统疾病、恶性肿瘤和自身免疫系统疾病者。所有患者均采用VAC装置行NPWT。本研究经我院伦理委员会批准，且患者均同意且签署知情同意书。

1.2 NPWT方法及标本采集 所有患者均行创面准备(常规清除坏死组织)，时间为1周。NPWT的具体操作如下[11]：①创面常规消毒，清理坏死组织，保证创面及创腔无脓液和大块坏死组织残留；②根据创面大小设计、修剪敷料，敷料以稍大于创面为宜；③覆盖半透明性粘贴薄膜，使创面处于封闭状态；④将负压装置连接吸引管，此时的半透明薄膜和敷料因负压吸引而凹陷，若漏气则需重新封闭创面，其负压设置为-125 mmHg，疗程14 d；⑤治疗过程中密切注意有无漏气、出血、引流管堵塞等情况发生，如发现异常及时处理。每位患者于治疗前及治疗第14天，分别于创面中心取直径8 mm、厚度3 mm的肉芽组织[11]两份。一份置于4%多聚甲醛溶液中,固定后行免疫组织化学染色(免疫组化)，一份放于-80℃冰箱中保存。标本收齐后，采取Western blot和Real-time PCR分析EDA+FN蛋白及基因表达情况。

1.3 免疫组化分析EDA+FN表达情况 创面肉芽组织样本经切片机切成5 μm的薄片，经脱蜡、水化，再加入3%过氧化氢以消除内源性过氧化物酶活性，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后加入EDA+FN第一抗体(ab6328, abcam)，并置于4℃环境下过夜，后在室温下加入第二抗体，并于37℃环境下放置20 min，再加入亲和素-生物素复合物(ABC)试剂显色，最后于显微镜下观察。每个切片随机选取10个视野进行拍照，应用图像分析软件(数码医学图像分析系统Motic Medical 6.0)测量糖尿病足患者肉芽组织切片每个区域的EDA+FN面密度值，计算平均值，用平均面密度值表示每张切片EDA+FN含量，并对其进行半定量分析。

1.4 Western blot法分析EDA+FN表达情况 创面肉芽组织加入1 ml RIPA组织裂解液中冰浴匀浆，裂解20 min，8000 r/min 离心10 min后取上清液，应用BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海生工生物工程有限公司)测定上清液蛋白浓度。取30 μg蛋白样品，加入5倍的蛋白上样缓冲液混合后煮沸5 min使其变性，经10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳梯度分离，转印至PVDF膜，后用5%脱脂奶粉封闭2 h，再分别与EDA+FN及内参β-Actin第一抗体(1∶500稀释)混匀后4℃孵育过夜，次日经TBST缓冲液冲洗3次，加入由辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体(1∶10000稀释)常温孵育2 h。使用高灵敏度ECL化学发光试剂盒检测蛋白条带，用Quantity One软件(美国Bio-Rad公司)对目标蛋白进行定量分析，以β-Actin为内参基因，计算EDA+FN蛋白的相对表达量。

1.5 Real-time PCR法分析EDA+FN基因表达情况 采用Trizol法提取肉芽组织总RNA，经纯度及完整性检测后进行反转录。应用反转录试剂盒合成第一链cDNA，反应体系20 μl，分别为：5×buffer 4 μl，dNTP 2 μl，Rnasin核糖酶抑制剂1 μl，RNA提取液5 μl，Random Primer 1 μl，M-MLV(反转录酶)1 μl，Nucleasr-Free Water 6 μl。各样本取1 μl反转录液进行Real-time PCR反应，反应体系20 μl，分别为：2×SYBR Green PCR Master Mix (Fermentas, USA)10 μl，上、下游引物(10 μM)各1 μl，模板1 μl，去离子水7 μl。PCR热循环参数：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火及延伸1 min。

所用引物如下：EDA+FN上游引物：5′-CTGACACAACAAACGGCTG-3′，下游引物：5′-GTGAGTAACGCACCAGGAAG-3′[12-13]。PCR反应在ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems， USA)进行，以GAPDH为内参基因，计算EDA+FN基因表达情况。

2 结果

2.1 一般资料比较 两组年龄、性别、空腹血糖、糖化血红蛋白、溃疡时间、血肌酐等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

2.2 EDA+FN表达比较 与本组治疗前比较，两组治疗后EDA+FN面密度值、EDA+FN相对蛋白表达量、EDA+FN相对mRNA表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；0.7≤ABI≤0.9组治疗后EDA+FN面密度值、EDA+FN相对蛋白表达量及EDA+FN相对mRNA表达量较0.5≤ABI<0.7组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01),见表2、图1～3。

表1 采用创面负压治疗的踝肱比值不同的糖尿病足两组一般资料比较

注：FPG为空腹血糖，ALT为丙氨酸转氨酶；ABI为踝肱比值；*指Fisher检验

表2 采用创面负压治疗的踝肱比值不同的糖尿病足两组EDA+FN相关指标比较

注：与本组治疗前比较，bP<0.01；与0.5≤ABI<0.7组比较，dP<0.01；ABI为踝肱比值

图1 采用创面负压治疗的踝肱比值不同的糖尿病足两组免疫组织化学分析EDA+FN表达(箭头所指为阳性因子)ABI为踝肱比值

图2 采用创面负压治疗的踝肱比值不同的糖尿病足两组Western blot法分析EDA+FN表达ABI为踝肱比值

图3 采用创面负压治疗的踝肱比值不同的糖尿病足两组Real-time PCR法分析EDA+FN基因表达ABI为踝肱比值

3 讨论

糖尿病足是由于糖尿病合并神经病变及不同程度末梢血管病变而引起的下肢感染、溃疡形成和(或)深部组织破坏，是导致糖尿病患者致残、致死的严重并发症之一。由于糖尿病足创面的发病机制、临床表现及病理特点较为复杂，具有特殊性，创面常迁延不愈，甚至可致截肢(趾)等严重后果，故临床急需寻找有效的治疗方法。近年国内外临床随机对照试验及系统综述分析显示，与标准换药法相比，NPWT可促进糖尿病足创面肉芽组织生长，缩短愈合时间，无严重不良反应及并发症，是治疗糖尿病足安全、有效的方法之一[5-6,14]。然而，NPWT对不同缺血创面的治疗效果的相关机制有待于进一步研究。cFN是细胞外基质的重要组成之一，其中EDA+FN是促进创面愈合的重要因素之一[7-8]。糖尿病性创面常因血管神经病变、感染、局部高血糖、糖基化终末产物、氧化应激、异常炎性因子等因素导致创面局部微环境改变，从而促进FN降解增加，致创面迁延不愈[15-17]。

Arslan等[18]观察糖尿病患者足部行NPWT治疗前后pFN的变化，结果显示治疗后pFN表达增加，但未对EDA+FN进行相关研究。为探讨NPWT对糖尿病足不同缺血创面肉芽组织EDA+FN的影响，本研究以糖尿病足为研究对象，结果显示两组经NPWT后，创面肉芽组织EDA+FN沉积较治疗前明显增多，且0.7≤ABI≤0.9组增多更为明显，同时创面肉芽组织EDA+FN蛋白及基因表达水平与治疗前相比均提高，且0.7≤ABI≤0.9组EDA+FN蛋白和mRNA相对表达量升高更明显。本文研究表明，NPWT可显著提高0.7≤ABI≤0.9组糖尿病足创面肉芽组织EDA+FN的表达。

综上，NPWT对不同缺血糖尿病足创面肉芽组织EDA+FN的表达有所不同，对轻度缺血患者肉芽组织EDA+FN的作用更明显，随着缺血程度的加重，NPWT对创面肉芽组织EDA+FN的表达可能下降，从而影响NPWT对糖尿病足创面的治疗效果，本研究为NPWT在糖尿病足创面的治疗选择上提供参考依据。

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Effect of Negative Pressure Wound Therapy on EDA+FN Level in Different Ischemia Granulation Tissues of Diabetic Foot Wounds

YANG Shao-ling1, ZHU Lyu-yu1, HU Li-ye1, LIU Yang2, WU Shan2
(1. Department of Endocrinology, Bethune Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China; 2. Graduate School of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)

Objective To investigate effect of negative pressure wound therapy (NPWT) on EDA+FN level in different ischemia granulation tissue of diabetic foot wounds. Methods A total of 30 diabetic feet fitting the inclusion criteria during January 2014 and January 2016 were divided into 0.5≤ABI<0.7 group (n=15) and 0.7≤ABI≤0.9 group (n=15) according to ABI (ankle brachial index) value. All patients

NPWT. Granulation tissues of wounds were collected before treatment and at the 14thd of treatment to observe the changes of EDA+FN. Results Compared with those before treatment in same group, values of area density of EDA+FN, relative protein expression of EDA+FN and relative mRNA expression of EDA+FN were significantly increased after treatment in both groups (P<0.01). After treatment, values of area density of EDA+FN, relative protein expression of EDA+FN and relative mRNA expression of EDA+FN in 0.7≤ABI≤0.9 group were significantly higher than those in 0.5≤ABI<0.7 group (P<0.01). Conclusion NPWT has different effects on EDA+FN levels in different ischemia granulation tissue of diabetic foot wounds. EDA+FN levels in different ischemia granulation tissue of diabetic foot wounds may decrease with aggravated ischemia degree.

Diabetic foot; Negative pressure wound therapy; Granulation tissue

河北省科技支撑计划项目(12277725)

050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院内分泌科(杨少玲、朱旅云、胡丽叶)；050000 石家庄，河北医科大学研究生学院(刘洋、武珊)

R587.29

A

1002-3429(2017)06-0092-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.06.033

2017-02-20 修回时间：2017-03-22)