曹觅+许丽琴+刘清忠+齐旭升

[摘要] 目的 觀察藻蓝蛋白对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 将48只SPF级SD大鼠左冠状动脉前降支用丝线结扎30 min后恢复灌注的方法建立急性心肌缺血再灌注损伤模型，术后随机分为模型对照组和藻蓝蛋白A、B组，另取8只不造模作为空白对照组。藻蓝蛋白A、B两组用藻蓝蛋白混悬液[100、400 mg/（kg·d）]灌胃给药治疗10 d，空白对照组和模型对照组等量生理盐水灌胃。检测静脉血总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性及大鼠左心室缺血区心肌组织丙二醛（MDA）含量，免疫组化技术检测各组大鼠心肌细胞内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，图像分析法检测冠状动脉细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21和P27的表达。 结果 经藻蓝蛋白治疗后，藻蓝蛋白A、B两组T-SOD和GSH-PX活性明显提高，MDA显著降低，冠状动脉P21和P27基因高表达，iNOS阳性细胞数明显减少，与模型组和本组成模后比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；藻蓝蛋白A、B组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 藻蓝蛋白通过促进蛋白依赖激酶抑制因子P21和P27 基因表达，提高T-SOD和GSH-PX酶活性，抑制缺血心肌产生iNOS及脂质过氧化反应对心肌细胞的破坏，降低心肌细胞病理性血管重构而达到心肌保护作用。

[关键词] 大鼠；藻蓝蛋白；急性缺血再灌注；蛋白依赖激酶抑制因子P21、P27

[中图分类号] R332；R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（b）-0025-04

[Abstract] Objective To observe the protective effects of phycocyanin on myocardium in rats with acute myocardial ischemia reperfusion injuries （MIRI）， and explore the mechanism. Methods The model of acute myocardial ischemia reperfusion injury was established by ligating the left anterior descending coronary artery of 48 SPF SD rats with 30 min after reperfusion， then they were divided into 3 groups： model control group， phycocyanin group A and group B， another 8 rats were selected as normal control group. Rats in phycocyanin group A and group B were treated with phycocyanin by intragastric administration [100， 400 mg/（kg·d）] for 10 d， rats in model control group and normal control group were treated with the same does of 0.9% sodium chloride solution by intragastric administration. The activity of T-SOD and GSH-PX were detected in the tail venous blood， the content of MDA in myocardium was detected， the expression of iNOS in cardiac myocytes was detected by immunohistochemistry. The expression of cyclin dependent kinase inhibitor P21 and P27 in coronary artery was detected by image analysis. Results Compared with model control group and after modelling， the activity of T-SOD and GSH-PX in group A and group B improved significantly， the content of MDA reduced significantly， the expression of cyclin dependent kinase inhibitor P21 and P27 in coronary artery improved significantly， the expression of iNOS in cardiac myocytes reduced significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Phycocyanin group A were compared with Phycocyanin group B， the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Phycocyanin can protect myocardium with MIRI by promoting P21 and P27 gene expression， improving T-SOD and GSH-PX enzyme activity， controlling iNOS and lipid peroxidation of ischemic myocardium and reducing the myocardial cell pathological vascular remodeling.

[Key words] Rat； Phycocyanin； Acute myocardial ischemia reperfusion injuries； Cyclin dependent kinase inhibitor P21， P27

急性心肌缺血再灌注损伤是引起致死性心脏疾病的主因，在抢救和治疗过程中造成心肌组织损伤的主要因素不是缺血本身，而是缺血区心肌组织在恢复血供后，血液中的氧与受损心肌细胞或坏死心肌细胞的溶解物质反应后形成的氧自由基破坏组织细胞并造成的缺血再灌注损伤[1]。在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类如总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）酶合成能力发生障碍时均会加剧自由基对缺血后再灌注组织的损伤，表现为急性心肌细胞坏死、凋亡、线粒体功能障碍、冠状动脉细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21和P27低表达，最终引起心肌细胞病理性血管重构而导致心肌功能抑制[2-3]。在临床上急性心肌梗死、冠脉搭桥、冠脉溶栓、梗死心肌再通等治疗均有可能发生缺血后再灌注损伤，使用超氧化物歧化酶（SOD）清除自由基可减轻缺血再灌流组织损伤而对心肌起到保护作用[4]。研究表明，藻蓝蛋白具有抗炎、抗过敏、维持机体稳态、清除自由基等众多的药理活性[5-6]。目前关于藻蓝蛋白对组织缺血再灌注损伤主要局限在脑缺血再灌注损伤方面，且对其有肯定的治疗作用，但对急性心肌缺血再灌注损伤却鲜有研究，本研究选用大鼠建立急性急性心肌缺血再灌注损伤模型，重点观察藻蓝蛋白对引起心肌细胞病理性血管重构的P21、P27和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达及抗脂质过氧化的影响，研究藻蓝蛋白对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级SD大鼠56只，鼠龄7周，体重（180.0±0.1）g，设空白对照组（8只）；余下48只随机分为模型对照组，藻蓝蛋白A、B组，每组各16只。大鼠购自湖北省实验动物中心，合格证：SYXK（鄂）2016-0031。

1.2 仪器及試剂

BL-420S生物机能实验记录系统（成都泰盟）；BW-BM1103小动物呼吸机（上海软隆科技发展有限公司）。藻蓝蛋白（浙江宾美生物科技有限公司，批号：11016 152）；戊巴比妥钠（上海哈灵生物科技有限公司，批号：160224）；GSH-PX、T-SOD和MDA测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：BA8350、A003-6、A003-1）。兔抗P21、P27多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：LS-C211591、LS-C211597）。

1.3 造模与治疗

参照文献[7]方法，用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，模型对照组、藻蓝蛋白A、B组三组大鼠均采用结扎左冠状动脉前降支30 min后恢复灌注的方法造成大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型造模。空白对照组不手术造模。造模过程中注意不要损伤胸膜，并用BW-BM1103小动物呼吸机控制呼吸以免造成气胸。造模成功标准：在结扎左冠状动脉前降支前接好Ⅱ导联导线，结扎后记录Ⅱ导联心电图（BL-420S生物机能实验记录系统），以心电图出现T波高耸、ST段明显抬高或上移、期前收缩等典型心电图改变为模型复制成功[8]。成模后2 h，藻蓝蛋白A和B两组用藻蓝蛋白混悬液[按100、400 mg/（kg·d）]灌胃给药治疗10 d，空白对照组和模型对照组灌等量生理盐水。

1.4检测指标及方法

1.4.1 酶及脂质代谢产物测定 给药10 d后分别从尾静脉血取静脉血0.1 mL，采用酶联免疫吸附法测定T-SOD、GSH-PX活性，取血后处死大鼠，取左心室缺血心肌组织检测MDA含量[9]。

1.4.2 免疫组化染色检测 各组在成模后2 h各取6只，治疗10 d时取所有存活动物处死，迅速取心并用生理盐水冲洗干净，甲醛固定24 h后乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片（厚5 μm），HE染色后做病理观察。然后取上述切片，常规脱蜡，水化，室温下用0.03的过氧化氢反应10 min，蒸馏水冲洗干净；然后置于0.01 mol/L的枸橼酸缓冲液中加热至沸腾，冷却15 min后再次加热至沸腾，自然冷却后用PBS冲洗3 min；加一抗、二抗，37℃孵育1 h，辣根过氧化物酶标记后37℃孵育20 min，苏木紫复染（10 s），400倍光镜下片状棕黄色颗粒为iNOS阳性表达[10]。观察时每张切片随机选4个视野，每视野内分别计100个心肌细胞中iNOS阳性细胞数。检测P21和P27的表达时，先将缺血区心肌组织提取蛋白并定量，分别用兔抗P21、P27多克隆抗体孵育1 h，加辣根过氧化酶标记，孵育1 h后用DAB显色，用图像分析仪扫描以确定P21、P27光密度（蛋白灰度值OPTDI）值[11]。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，组间差异则采用两样本均数Dunnett检验。以P < 0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 大鼠治疗后心肌及冠状动脉病理观察

在治疗10 d时模型对照组，藻蓝蛋白A、B组各存活6、10、9只，藻蓝蛋白A、B组存活率高于模型对照组（P < 0.05）。对存活大鼠病理观察发现，模型对照组心肌纤维纵横纹模糊，肌纤维肥大、溶解、断裂且纤维间出现颗粒及脂肪样变性。光镜下可观察到冠状动脉平滑肌细胞组织切片边缘呈典型的“峰-谷”现象，血管内皮剥脱、并有新生内膜，血管管壁损伤、狭窄，出现明显的病理性血管重构，提示造模成功。藻蓝蛋白A、B组大鼠心肌纤维较模型对照组纵横纹比较清晰，排列相对整齐，肌纤维间质仍可见少量纤维细胞增生、轻度肥大。光镜下也可观察到冠状动脉平滑肌细胞组织切片边缘无“峰-谷”现象，无血管内皮剥脱、新生内膜较模型对照组减少69%，冠状动脉管腔增大，病理性血管重构明显好转。藻蓝蛋白A、B组组间病理观察比较无明显区别。

2.2 藻蓝蛋白对大鼠活性酶及脂质代谢产物的影响

与空白对照组比较，模型对照组成模后和治疗10 d T-SOD和GSH-PX活性明显降低，MDA显著提高（P < 0.05）。藻蓝蛋白A、B组治疗10 d时T-SOD和GSH-PX活性明显提高，MDA显著降低，与模型对照组和同组成模后比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。藻蓝蛋白A、B组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 藻蓝蛋白对大鼠P21和P27表达的影响

模型对照组成模后和治疗10 d后P21和P27均低表达，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。藻蓝蛋白A、B组成模后低表达，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），治疗10 d高表达，与模型对照组、空白对照组和同组成模后比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。藻蓝蛋白A、B组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.4 藻蓝蛋白对大鼠心肌细胞中iNOS表达的影响

模型对照组成模后和治疗10 d后iNOS阳性细胞数增多，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P <0.05）。藻蓝蛋白A、B组成模后iNOS增多，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），治疗10 d显著降低，与模型对照组、同组成模后比较，差异有统计学意义（P < 0.05），但未治疗降到正常水平，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。藻蓝蛋白A、B组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

医学工作者在治疗心肌缺血性疾病时，如何防止或减轻急性心肌缺血再灌注损伤造成猝死等严重不良事件的发生而做出了大量研究工作，其研究的重点在于寻找高效、低毒、有效的抑制脂质过氧化反应、清除自由基、维持机体稳态、降低心肌细胞病理性血管重构而达到心肌保护作用的药物。研究表明，血管平滑肌细胞的过度增殖是动脉粥样硬化和冠状动脉介入治疗后再狭窄等血管增殖性疾病的主要病理机制[12]。P21和P27作为细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子，对细胞周期起到负调控作用，其表达增强可抑制血管平滑肌过度增殖，对心肌细胞及血管平滑肌病理性重构起关键调控作用[13-14]。iNOS作为一氧化氮诱导酶，高表达可产生大量一氧化氮，引起细胞DNA损伤及线粒体呼吸抑制，造成血管内皮细胞严重损伤，而脂质过氧化产物MDA会加重心肌损伤[15-16]。T-SOD和GSH-PX酶是清除清除自由基、抑制脂质过氧化反应的重要的酶[17-18]。研究表明，藻蓝蛋白具有口服无毒性、可清除羟自由基和氢过氧自由基的抗氧化活性[19-20]。故在本研究中，选择了以上引起心肌病理构象改变的重要影响因素不研究藻蓝蛋白对急性心肌缺血再灌注损伤的影响。

本研究结合组织病理观察，发现藻蓝蛋白A、B组大鼠心肌细胞及冠状动脉平滑肌细胞病理性血管重构现象明显好于模型对照组，且经藻蓝蛋白治疗后，藻蓝蛋白A和B两组T-SOD和GSH-PX活性明显提高，MDA显著降低，冠状动脉 P21和P27 基因高表达，iNOS阳性细胞数明显减少。因此，本研究证实藻蓝蛋白具有抗冠状动脉平滑肌内皮细胞过度增殖性管腔狭窄的作用，这一现象应与藻蓝蛋白通过上调细胞周期关键抑制因子 P21和P27的基因表达，抑制血管平滑肌过度增殖有关。另外，藻蓝蛋白还通过抑制iNOS表达来降低一氧化氮对心肌细胞DNA 损伤及线粒体呼吸抑制作用，减轻血管内皮细胞损伤。藻蓝蛋白还可提高T-SOD和GSH-PX活性，促进急性心肌缺血再灌注清除自由基，抑制脂质过氧化反应而对心肌起到保护作用。

综上所述，藻蓝蛋白可提高T-SOD和GSH-PX酶活性、清除自由基，抑制脂质过氧化反应对心肌细胞的破坏，并通过促进蛋白依赖激酶抑制因子P21和P27 基因表达、抑制缺血心肌产生iNOS，降低由此导致的心肌细胞病理性血管重构而达到心肌保护作用，有进一步开发成为抗缺血再灌注损伤的药物价值。

[参考文献]

[1] 胡一冰，林玉琳，赵艳芝，等.国外心肌缺血/再灌注引发的细胞凋亡的治疗研究进展[J].中国医药导报，2013，10（5）：32-34.

[2] Kumar D，Bhaskn M，Alagappan L，et al. Heme oxygenase-1 modulates mesangial cell proliferation by p21 Wafl upregulation [J]. Ren Fail，2010，32（2）：254-258.

[3] Herr I，Debatin KM. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy [J]. Blood，2001，98（9）：2603-2614.

[4] 周玉，王伶俐，黄杨，等.糖尿病大鼠的SOD活性与抗氧化剂治疗对机体抗氧化状态的影响[J].中国实验动物学报，2016，24（4）：422-426

[5] 王超，孙峰，丁晓洁，等.藻蓝蛋白在脑缺血再灌注损伤过程中的抗氧化作用[J].中华老年心脑血管病杂志，2007， 9（5）：345-347.

[6] 夏冬，孙军燕，刘娜娜，等.藻蓝蛋白抗氧化作用及其药理活性研究进展[J].海洋科学，2015，39 （7） ：130-135.

[7] 李袁静，蔡明，陈知水，等.建立小鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型手术技巧及TTC 染色方法探讨[J].山东医药，2010，50（40）：42-44.

[8] 王文杰，陈红英，彭吉霞，等.红景天苷对大鼠心肌缺血预处理后血管内皮生长因子表達的影响[J].中国医药导报，2015，12（9）：29-33.

[9] 王程，杨金平，罗炜，等.藻蓝蛋白、铁皮石斛多糖及两者配伍对辐射损伤模型小鼠保护作用的研究[J].中南药学， 2016，4（10）：1032-1036.

[10] 沈卫，马璇，刘琳，等.藻蓝蛋白对2型糖尿病大鼠心肌细胞内iNOS表达影响[J].青岛大学医学院学报，2010， 46（4）：283-285.

[11] 褚现明，冷敏，安毅，等.藻藍蛋白抑制血管平滑肌细胞过度增殖性管腔狭窄的机制研究[J].中国药理学通报，2012，28（10）：1383-1388.

[12] 褚现明，安毅.易损血液与动脉粥样硬化症关系研究进展[J].心血管病学进展，2009，30（5）：867-871.

[13] Lee MS，Yang T，Dhoot J，et al. Meta-analysis of studies comparing coronary artery bypass grafting with drug-eluting stenting in patients with diabetes mellitus and muhtivessel coronary artery dis-ease [J]. Am J Cardiol，2010， 105（11）：1540-1544.

[14] 褚现明，李冰，杜日映，等.P27 对大鼠胸主动脉球囊损伤后管腔狭窄的作用[J].中国动脉硬化杂志，2006 ，14（5）：417-421.

[15] 陈德.氧化还原信号在心肌缺血再灌注损伤中保护作用机制的研究进展[J].中国循环杂志，2013，28（7）：545.

[16] White BC，Sullivan JM，DeGracia DJ，et al.Brain ischemia and reperfusion：molecular mechanisms of neuronal injury [J]. J Neurol Sci，2000，179（Suppl 1-2）：1-33.

[17] 赵艳景，胡虹，王颖 .藻蓝蛋白生理活性及作用机制研究进展[J].安徽农业科学，2011，39 （11） ：6332-6333.

[18] 韩磊，叶平，李鸣皋，等.阿托伐他汀对老年大鼠心肌过氧化氢、丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶水平的影响[J].解放军医药杂志，2014，26（2）：44-46.

[19] 周站平，陈秀兰，陈超，等.藻胆蛋白脱辅基蛋白对其抗氧化活性的影响[J].海洋科学，2003，27（5）：77-81.

[20] 宋璐非，刘冰，赵勇，等.天然藻蓝蛋白对 SD大鼠的长期毒性研究[J].中国医药导报，2012，9（3）：15-21.

（收稿日期：2017-01-21 本文编辑：苏 畅）