陈海妮 沈卫民 崔杰 陈建兵 韩涛 季易 高庆文

皮肤软组织扩张术对儿童表皮细胞PAX3表达的影响

陈海妮 沈卫民 崔杰 陈建兵 韩涛 季易 高庆文

目的 比较儿童行皮肤软组织扩张术前后表皮细胞配对盒子（paired box 3,PAX3）表达的差异，为探讨其临床作用机制提供依据。方法 通过HE染色和免疫组化染色，比较扩张前后皮肤软组织切片和表皮细胞PAX3蛋白平均光密度变化的情况。结果 扩张后表皮中黑素细胞增多，PAX3阳性区域平均光密度在扩张后为0.37±0.05，且显著高于扩张前0.28±0.06，其差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 皮肤软组织扩张术在一定程度上会导致黑素细胞数目增多，可能与儿童表皮细胞PAX3基因表达增加有关。

皮肤软组织扩张术；黑素细胞；配对盒子；儿童

皮肤软组织扩张术用于儿童在整形外科中的治疗日渐增加，其作用机制可能与扩张器注水后产生的机械应力增加，诱导皮肤组织中产生多种细胞因子而促进组织生长密切相关。但临床观察发现，有部分患儿的扩张区域皮肤色素呈加深现象，具体机制不详。既往研究提示，儿童在烧伤、瘢痕、皮肤移植、外伤或手术后可引起暂时性或永久性的色素沉着[1]。因此，皮肤软组织扩张术对儿童皮肤色素影响的机制亟待探究。黑素细胞能合成分泌黑素小体，是各种因素导致皮肤色素加深的靶细胞，其在表皮层中的分布改变与皮肤色素有关；配对盒子（paired box3,PAX3）是调节黑素细胞活力重要的转录因子，PAX3在胚胎发育的早期参与黑色素母细胞的形成，并激活不同的下游靶基因参与黑素细胞的增殖、分化和生存途径迁移[2]。本研究通过观察儿童皮肤软组织扩张术前、后皮肤切片的组织细胞形态学变化，并使用免疫组织化学方法对比表皮中PAX3蛋白表达变化情况，以期更深入地研究扩张术的机制，旨在为临床应用提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选择自2012年1月至2015年12月南京医科大学附属儿童医院烧伤整形科收治的27例行皮肤软组织扩张术和扩张皮瓣转移术患儿的皮肤标本进行自身对照研究。术前均签署知情同意书。男性14例，女性13例；年龄3～11岁。其中，面颈部11例，胸部7例，上肢部9例。皮肤软组织扩张术后，常规行间断注水扩张6～8周；组织标本均取自皮肤软组织扩张器埋置和扩张皮瓣转移术中。扩张后的标本在皮瓣中部取材，以免造成皮瓣损伤；对照标本取自扩张器埋置术前的切口周缘正常皮肤组织。每部位切取3 mm×3 mm×3 mm的组织块，用于组织病理学和免疫组织化学检测。

1.2 HE染色组织切片分析 每张切片均由有经验的病理医师进行病理诊断，并在光镜下观察表皮组织及皮肤附件的改变。

1.3 PAX3蛋白免疫组化染色阳性区域平均光密度分析 将取材组织用4%多聚甲醛固定过夜，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡和石蜡包埋后切片。蜡块组织3 μm厚切片，梯度脱蜡后PBS缓冲液冲洗，微波修复抗原；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶后，经PBS缓冲液冲洗；切片加入稀释好的兔抗人单克隆抗体PAX3（英国ABCAM公司），稀释度为1∶50，室温孵育1 h，PBS缓冲液冲洗；加入二抗后，室温孵育10 min，PBS缓冲液冲洗；滴加DAB显色液，用蒸馏水冲洗后行苏木素复染，自来水冲洗，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。然后用PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。每张免疫组化切片随机在400倍显微视野下，选择5个独立区域进行彩色图像拍照采集，胞浆和胞核出现黄或棕黄色颗粒者为阳性，同时将图片导入Image Pro.Plus 6.0软件，计算出每个视野中PAX3平均光密度值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。对实验数据以±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色 在200倍光镜下观察扩张前后表皮组织变化，可见网状纤维大量增生（图1），以附件和毛细血管周围较为明显，真皮乳头层的弹力纤维呈大量增生；扩张术后，表皮基底层黑素细胞较术前明显增多，且与黑素细胞相邻近的角朊细胞中的黑素颗粒也明显增多。黑素细胞位于表皮基底细胞和棘细胞之间，其胞浆和/或胞核呈黄色或棕黄色颗粒。扩张术后，黑素细胞主要分布于表皮基底层与角质形成细胞之间；基底膜带中的黑素细胞比例较术前明显增多。

2.2 PAX3蛋白免疫组化染色 在400倍光镜下观察PAX3阳性着色主要位于表皮角质形成细胞和黑素细胞的胞浆和胞核（图2），呈黄色或棕黄色。PAX3阳性区域平均光密度分析，扩张组为0.37±0.05，显著高于对照组0.28±0.06，其差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

目前，皮肤软组织扩张术是整形外科中用于儿童获取自体皮肤的重要方法，因此，在儿童的瘢痕修复、皮肤肿瘤切除等方面应用较广泛[3]。其机制主要以组织扩张的方法达到皮肤面积增加和皮肤血管的新生。但已知机械应力会造成显著的组织学改变，从而影响皮肤组织细胞的骨架结构、细胞外基质、酶和信号转导系统的变化；杨登峰等[4]研究显示，大鼠扩张后的皮肤表皮层明显增厚，真皮层变薄；免疫组织化学染色可见增殖细胞呈点状分布，主要集中于表皮基底层和毛囊鞘；这可能对表皮不同类型的细胞增殖产生影响，且间接影响皮肤的质地与色泽。儿童处于生长发育期，应用皮肤软组织扩张术可能产生皮肤色素改变，其机制较为复杂，部分原因可能与扩张术后血运变化、手术创伤和炎症刺激等有关。

皮肤黑素细胞是位于表皮基底层的树突状细胞，能合成分泌黑素小体。成熟后的黑素小体经黑素细胞树突转运至角质形成细胞，而角质形成细胞中黑素小体的多少、大小和聚集方式，则主要影响皮肤的颜色。既往对扩张后皮肤色素改变情况缺乏探讨，本研究通过对比扩张前、后组织切片，观察到扩张后皮肤黑素细胞的数量增多，PAX3染色显著增强，间接说明扩张术可以增强黑素细胞的活性，这或许与皮肤软组织扩张术增加局部皮肤机械应力同时，促进了扩张区域PAX3等生长因子的合成与释放，间接地促进了黑素细胞的增殖有关。

PAX3是生物体中普遍存在的一种重要转录因子，高度表达于黑素细胞，包括其干细胞和成熟的分化细胞；对黑色素母细胞的分化、迁移、增殖以及分化为黑色素细胞，均起到了重要的作用；黑素细胞作为皮肤的色素产生细胞，由PAX3在胚胎发育早期转录形成[5]；PAX3还能促进黑色素母细胞从神经嵴中迁移，促使黑色素干细胞从毛囊迁移至皮肤的真皮乳头处[6]。目前研究认为，皮肤色素沉着主要与黑素细胞的功能有关，PAX家族参与了其中的部分功能[7]。皮肤软组织扩张术可通过产生的机械应力激活多种生长因子，并通过释放碱性成纤维细胞生长因子等生物活性物质，进一步促进黑素细胞的增殖。有研究证实，成纤维细胞生长因子蛋白2（fibroblast growth factor 2,FGF2）可通过信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）激活PAX3转录并调节黑素细胞活力[8]。因此，笔者认为，扩张术后的表皮细胞内PAX3染色颗粒增多，可能与组织扩张后机械应力增加、继发产生的炎症因子及生长因子表达增加、激活了PAX3的转录和表达有关。这从分子水平阐释了皮肤软组织扩张术可通过增加机械应力促使黑素细胞表达和分布。

图1 扩张术前后表皮组织变化（HE×200） a.扩张术前 b.扩张术后2个月图2 扩张术前后表皮组织PAX3蛋白变化（免疫组化染色×400） a.扩张术前 b.扩张术后2个月

PAX3基因在幼年黑素细胞从神经嵴至表皮/真皮边界迁移、发育过程中的表达发挥着重要作用，但在成年黑色素细胞中PAX-3表达显著减少[9-10]。本研究主要针对儿童皮肤扩张术后PAX3的表达增加进行了初步观察，对成人的具体影响仍需进一步探索，以期更全面地理解其具体信号转导机制，获取更理想的皮肤扩张效果。

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The Changes of PAX3 expression in pediatric skin after tissue expansion surgeries

CHEN Hai-ni,SHEN Wei-min,CUI Jie,CHEN Jian-bin,HAN Tao,JI Yi,GAO Qing-wen.(Department of Burned and Plastic Surgery,Nanjing Children Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing 210000,China)

Objective To investigate the change of paired box 3（PAX3）protein expression in 27 pediatric cases undergoing tissue expansion surgeries.Methods Hematoxylin and eosin stain (HE stain)was performed to detect histomorphology changes.PAX3 protein expression was evaluated with average optical density by immunohistochemical technique.Results Melanocytes in the epidermis increased after expansion.The average optical density of the PAX3 protein positive area was 0.37±0.05 after expansion,significantly higher than that before the expansion (P＜0.01).Conclusion Skin soft tissue expansion results in the increase ofmelanocytes toa certain extent.This maybe related tothe increased expression ofPAX3 in pediatric epidermic cells.

Skin soft tissue expansion;Melanocyte;Paired box;Children

SHEN Wei-min,Email:swmswmswm@sina.com

2016-09-17）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.02.015

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.02.015

南京医科大学附属儿童医院 烧伤整形科，江苏 南京 210000

沈卫民，Email：swmswmswm@sina.com

本文引用格式：陈海妮,沈卫民,崔杰,等.皮肤软组织扩张术对儿童表皮细胞PAX3表达的影响[J].中国美容整形外科杂志,2017,28(2)：115-117.