张猛++王琼++万东光++余向阳

摘要：为筛选新的防治西瓜枯萎病的生防菌菌种资源，采用稀释涂布平板法从番茄植株中分离得到对西瓜枯萎病菌具有显著抑制作用的拮抗菌，采用平板对峙法研究其对病原菌的广谱抑制效果，将菌体特征结合16S rDNA序列分析及生理生化指标相结合，对生防菌进行初步鉴定，明确其分类地位，并采用温室栽培试验对其进行抗病效果初探。结果表明，从番茄中分离的1株对西瓜枯萎病菌具有显著拮抗作用的菌株wm005，对西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黄瓜立枯病菌、草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、水稻恶苗病菌、葡萄炭疽病菌均表现出很强的抑制作用，具有广谱抗性。根据菌体特征、16S rDNA序列分析及生理生化指标的结果，初步鉴定该菌为死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis wm005）。温室栽培试验表明菌株wm005对由西瓜枯萎病菌引起的西瓜枯萎病具有显著的防治效果（防效为75.1%），高出化学药剂百菌清防效16.9百分点，说明菌株Bacillus vallismortis wm005具有很好田间应用开发的潜力。

关键词：死谷芽孢杆菌；分离；生防菌；西瓜枯萎病

中图分类号： S436.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0097-04

植物病害一直是威胁农业安全生产的重要因素，化学农药的长期大量使用一方面使得病原菌产生了抗药性，另一方面对人、畜和环境产生危害，由农药引起的食品安全问题已经受到广泛关注[1]。因此，采用高效、低毒、环境友好的治理技术来替代传统单一依靠化学农药来防治植物病害是生产中亟待解决的问题。生物防治因其对环境和人畜安全、不易产生抗药性、处理费用低廉等优点，已广泛应用于各种农林病虫害的防治[2，4]。生物防治（Biological Control）是指利用生物物种间的相互关系，以一种或一类生物抑制、消灭另一种或一類有害生物的防治方法[5-6]。在生物防治过程中，分离和筛选防效好、活性稳定、环境适应性强的可替代化学试剂的生防菌株资源是保证生物防治效果的前提[7]。

植物内生细菌是指某一时期生活在活的植物组织内而不引起明显病害症状，并与寄主和谐共存的细菌。植物内生菌作为最具防病潜力与应用价值的一类生防细菌，不仅能够促进植物生长，增加作物的产量，还能提高植株抗病能力，对植物本身而言也不是一个外来物种，从而成为许多学者研究的热点对象[8]。有资料显示，目前在各种农作物和经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种，分属于54个属，主要为芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、泛菌属（Pantoea）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）等[9]，为植物病害的生物防治提供了丰富的微生物资源。近年来内生菌领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物[10]。

本研究从番茄中分离筛选到1株对西瓜枯萎病菌具有显著抑制作用的拮抗菌，并结合菌体特征、16S rDNA序列分析及生理生化指标，对拮抗菌进行初步鉴定，确定其分类地位。同时，在温室盆栽条件下对分离的拮抗菌进行抗病效果初探，旨在为生物防治提供菌种资源。1材料与方法

1.1试验材料

供试致病菌株西瓜枯萎病菌（Fusarium oxyporum f. sp. niveum）由江苏省农业科学院产地环境研究室保存。试验中选用的西瓜品种为江苏省江蔬种苗科技有限公司培育的“苏蜜5号”。菌株培养基为马铃薯葡萄糖糖培养基（PDB）和Luria-Bertani培养基（LB）。菌株DNA提取、PCR扩增试剂，均购自宝生物工程（大连）有限公司。

试验仪器为：超净台（苏州净化），摇床（上海知楚），PCR仪（Eppendorf），扫描电镜（蔡司EVO18）。

1.2试验方法

1.2.1菌株的分离、纯化与保存该菌株分离自江苏省农业科学院蔬菜基地大棚内的番茄植株。采集番茄样品后，自来水洗风干，然后依次用75%乙醇浸泡1 min和8% NaClO浸泡4 min进行表面消毒处理，无菌水洗4次后，将根、茎、叶用无菌剪刀剪开，根和茎切成约1 cm的小段，放置于LB平板上；叶加水研磨至糊状，静置10 min后涂布LB平板，均放置于30 ℃培养48 h，选取不同形态特征的单菌落反复平板划线纯化后进行斜面保存。

1.2.2拮抗菌的筛选及广谱性验证采用对峙培养法筛选出对西瓜枯萎病病原菌具有抑制作用的菌株。首先，将尖孢镰刀菌在PDA平板上28 ℃培养5 d，用直径为5 mm的打孔器在平板上打取圆形琼脂块，将其接入PDA平板中央，28 ℃培养2 d，然后用灭菌牙签在病原菌菌饼两侧等距离处点接种分离得到的细菌，于培养箱中28 ℃培养3 d后观察记录抑菌圈。每个处理重复3次，有抑菌圈的菌株即为拮抗菌。为进一步验证分离的菌株对植物土传病害是否具有广谱抑菌效果，选取了如表1所示的另外6种常见的植物病原真菌进行进一步的抑菌试验。

1.2.3拮抗菌的鉴定形态学观察：将分离菌株划线接种于LB培养基，37 ℃培养48 h后观察菌落形态特征。采用结晶紫进行革兰氏染色，并利用扫描电镜观察菌体形态及大小。扫描电子显微镜（SEM）样品制备过程参见林英等的方法[11]略作调整。固定：取液体培养基中的菌体1 mL，4 000 r/min离心20 min，弃上清，并用生理盐水清洗3次，倒入2.5%戊二醛固定液于4 ℃过夜后，用生理盐水清洗3次。脱水：依次用30%、50%、70%、85%、90%的乙醇溶液梯度脱水处理，各浓度均处理15 min。再用100%的乙醇处理2次，每次 15 min。干燥：吸取混匀的细菌-醋酸戊脂悬浮液滴在盖玻片上，将滴有菌液的盖玻片分别于-70 ℃的冰箱冷冻12 h后，置于冷冻干燥机内真空干燥。扫描：将干燥后的样品放在真空镀膜机内镀金15 min后取出在扫描电镜中进行观察。

生理生化特征分析：37 ℃培养24～48 h后，生理生化特征按《伯杰细菌鉴定手册》[12]进行鉴定。

1.2.4拮抗菌的16S rRNA序列测定采用常规小量基因组提取方法，采用TaKaRa MiniBEST Bacterical GenomicDNA Extraction Ver. 2.0试剂盒，根据细菌16S rDNA的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以过夜培养的wm005菌体基因组为模板进行PCR扩增。PCR运行程序：预变性 94 ℃，10 min；变性94 ℃，45 s；退火56 ℃，40 s；延伸72 ℃，40 s，共35个循环；总延伸72 ℃，7 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到1条约1 400 bp的特异性片段，样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5盆栽试验盆栽试验在江苏省农业科学院日光温室内进行。将西瓜枯萎病菌在PDA平板上培养6～7 d，用孔径为20 mm的打孔器在培养基上打孔，取10片带菌培养基加入200 mL灭菌绿豆汤培养基中，于28 ℃、180 r/min摇床振荡培养7 d，用灭菌纱布（4层）过滤去渣，滤液于4 ℃、5 000 r/min 下离心10 min，去上清液取沉淀物（西瓜枯萎病菌分生孢子），用液体马铃薯培养基重悬后，用灭菌去离子水稀释使孢子浓度为1×107个/mL，28 ℃孵育60 min，然后将西瓜枯萎病菌的分生孢子液与灭菌的基质（营养土 ∶蛭石=1 ∶1）混合均匀，接种量为106个分生孢子/g基质，制成病土。将西瓜种子表面消毒后，无菌水浸泡过夜，30 ℃恒温催芽2 d。露白后播种于穴盘，待小苗长至2片真叶时，移栽至内径10 cm、高15 cm、内装300 g病土壤的塑料杯中。试验设3个处理，即拮抗细菌菌株wm005培养液（1×108 CFU/mL）、75%百菌清可湿性粉剂稀释500倍液（有效成分 1 500 mg/L）、對照LB空白培养液，每处理12株西瓜苗，3次重复。在移栽的同时，各处理分别在每株西瓜苗根部灌浇 10 mL 拮抗细菌菌株wm005培养液，以后每隔5 d灌浇1次，连续3次。在最后1次施药后第21天按照于思勤等的分级标准[13]调查西瓜苗发病情况，计算病情指数与防治效果。

1.3数据分析

采用SPSS 16.0统计软件中的ANOVA过程进行Duncans多重比较，检验组间差异显著性。数据表示为平均数±标准差（x±s）。

2结果与分析

2.1拮抗菌的分离及广谱性验证

通过平板对峙法对分离的细菌进行筛选，得到1株对西瓜枯萎病菌具有明显拮抗活性的菌株，将其命名为wm005。对菌株wm005进行抗菌谱测定，发现菌株wm005对油菜菌核病菌、黄瓜立枯病菌和草莓灰霉病菌具有非常强烈的抑制效果，且菌株wm005对小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、水稻恶苗病菌、葡萄炭疽病菌表现出了很强的抑制作用。由此可见菌株wm005在离体平板试验条件下对植物病原菌具有广谱的抑菌效果。

2.2拮抗菌鉴定

2.2.1形态特征供试菌株wm005为革兰氏阳性菌株，其电镜照片见图1，菌体呈杆状、无鞭毛、两端钝圆，能够产生椭圆形芽孢，长1.2～2.2 μm，宽0.6～0.8 μm。该菌株在LB培养基上30 ℃培养48 h后，菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干涩易起皱、易挑起。能在25～40 ℃的温度下生长，最适生长温度为32 ℃；生长pH值范围为4.0～9.0；最适pH值为6.5。生理生化测定结果（表2）表明，接触酶反应、V.P.试验、硝酸盐还原反应、石蕊牛奶还原胨化、淀粉水解反应、利用柠檬酸盐反应、葡萄糖酸盐、吲哚试验、甲基红反应、氧化酶试

2.2.216S rDNA序列分析菌株wm005经16S rDNA PCR扩增后，得到了1条约1 400 bp的目的条带，将目的片段胶回收后测序，为长度1407bp的DNA序列。将序列在NCBI数据库中采用Blast进行同源性比对（序列登记号为：KX094443），结合MEGA 6.0用邻接法（Neighbor-Joining，N-J）构建系统发育树（图2），wm005与Bacillus vallismortis同属1个遗传分支，亲缘性达到99%。结合形态特征观察以及生理生态特征分析，确定菌株wm005为死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis wm005）。

2.3盆栽试验

由表3可知，从番茄中分离的拮抗菌wm005在温室条件下对西瓜枯萎病菌引发的枯萎病有一定的防治效果，从病情指数上来看，接种菌株wm005的西瓜植株病情指数17.2，明显低于没有接种菌株wm005。只接种西瓜枯萎病菌的对照试验组（70.2），病情指数下降53。从防治效果来看，菌株

3结论与讨论

传统的生物防治是引入一个新生物来控制植物有害生物，但是多数难以取得成功，这是因为一个新物种的进入必然涉及到未知的风险。因此，客观地评估生物防治中的新物种对环境及其他物种带来的潜在危害至关重要[14]。植物内生细菌能够促进植物生长、增加作物的产量，还能提高植株抗病能力，对植物本身而言也不是一个外来物种，不存在上述潜在的危害，因此作为生防细菌具有巨大的防病潜力和重要的应用价值。国内外关于植物内生细菌防治植物病害报道很多。van Buren等从马铃薯茎组织中分离得到61株内生菌对马铃薯环腐病有防治效果[15]。Ren等在杨树干中发现的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）对杨树溃疡病菌有抑制作用，还对植物生长可以起到促进作用[16]。龙良鲲等从番茄根内筛选到18株内生细菌，在番茄的根部具有较强的定殖能力，在盆栽试验中对番茄青枯病菌具有一定的拮抗作用[17]。杨海莲等报道水稻苗期根内分离的阴沟肠杆菌（Enterobater cloacae），对水稻白叶枯病菌不表现体外拮抗作用，但是用其发酵液喷雾或浸种，都可以显著提高水稻对白叶枯病的抗性[18]。本试验从番茄植株中分离到1株对西瓜枯萎病菌具明显拮抗作用的内生菌株wm005，根据菌体特征、16S rDNA序列分析及生理生化指标，初步鉴定该菌为死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis wm005）。

芽孢杆菌可产生肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类等抗菌物质，不同种类的抗菌物质有不同的生物学活性，因此芽孢杆菌往往表现出对多种病害的广谱抗性。采用平板对峙试验对该菌株进行抗菌谱测定，结果表明菌株wm005对西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黄瓜立枯病菌、草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、水稻恶苗病菌、葡萄炭疽病菌均表现出了很强的抑制作用。由此可见菌株wm005对植物病原菌具有广谱的抑菌效果。

研究表明，很多生防菌在平板对峙试验中对病原菌表现出良好抑制效果，但是在植物活体或田间试验中却没有理想的防效[19-21]。在本试验中，内生生防细菌wm005不仅对西瓜枯萎病菌以及其他病原菌表现出了广谱的抑菌效果，而且在温室盆栽试验中，对西瓜枯萎病菌引起的西瓜枯萎病也具有较好的防治效果。但是由于实际田间环境相对温室条件而言要复杂得多，植物内生生防细菌wm005在田间实际应用中的防治效果还需要进一步研究。

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