柳岩，王杰，罗理勇,2，曾亮,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆 ,400715)2(西南大学 茶叶研究所，重庆 ,400715)

腌制时间对蜜制柠檬生化、感官和抗氧化特性的影响

柳岩1，王杰1，罗理勇1,2，曾亮1,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆 ,400715)2(西南大学 茶叶研究所，重庆 ,400715)

研究了蜜制柠檬腌制过程中还原糖、柠檬酸、柠檬苦素、抗坏血酸(Vitamin C，VC)、总多酚含量的变化，用1,1-二苯-2-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)法和氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法测定蜜制柠檬腌制过程中抗氧化能力的变化，并对不同腌制时间的蜜制柠檬进行感官评价。结果表明：还原糖含量在腌制过程中没有发生明显变化，柠檬酸、柠檬苦素、VC、总多酚的含量明显降低，腌制120 h后，柠檬酸、柠檬苦素、VC、总多酚的含量分别降低了32.73%、62.78%、59.21%、43.49%；蜜制柠檬的抗氧化能力在腌制前期明显下降，而在腌制后期趋于稳定，其中总多酚含量与DPPH值和ORAC值呈极显著正相关；感官评价得分随腌制时间的增加呈现先升高再降低的趋势，腌制48 h所得样品感官评价总分最高，但腌制24 h、48 h样品的感官评价总分差异不显著。

蜂蜜；柠檬；腌制；抗氧化；感官评价

柠檬(Citruslimon(L.)Burm．F.)属芸香科柑橘属常绿小乔木，主要栽培品种有尤力克、里斯本、费米耐劳等，是继橙、柑之后第三大柑橘品种。柠檬果实中含有的类黄酮、维生素、膳食纤维、香精油、类胡萝卜素和生物碱等成分具有抗氧化、抗癌、减肥、抗炎症、抗过敏及抗菌等生理功能[1]。近年来柠檬的消费量不断上升，以柠檬为原料生产的休闲食品日益受到人们的喜爱，如：柠檬皮低糖蜜饯、柠檬饮料、柠檬果醋、糖渍柠檬、盐渍柠檬和柠檬茶等[2]。

蜂蜜中含有180多种活性物质，其主要成分为果糖、葡萄糖及4%～ 5%的低聚果糖，同时还含有丰富的维生素、活性酶、类黄酮、多酚类及多种矿物质[3]，具有抗氧化、抗菌、加速创伤修复、增强免疫力等多种生理活性[4-5]；此外，蜂蜜还能用于治疗肝炎、癌症、伤口感染、便秘以及改善胃肠功能、提高机体免疫力等[3]。

蜜制柠檬是以蜂蜜腌制柠檬片(或柠檬果匀浆)制成的可以直接冲泡饮用的休闲食品，干燥后便于携带和食用。目前，由于蜜制柠檬的制作工艺存在随意性，导致其品质稳定性不高，且其营养和功能成分的研究尚不明确。本文通过检测蜜制柠檬腌制过程中的生化成分(还原糖、抗坏血酸、柠檬酸、总多酚、柠檬苦素)含量及抗氧化能力的变化，感官评价蜜制柠檬品质和风味，分析与抗氧化能力相关的主要生化成分，为蜜制柠檬的生产加工提供一定基础数据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬购于四川省安岳县，品种为尤力克。蜂蜜使用枣花蜜，购于福建农林大学蜂疗研究所。

Na2CO3、福林酚、无水乙醇、没食子酸、NaOH、酒石酸钾钠、苯酚、NaHSO3、无水葡萄糖、KOH、KH2PO4、K2HPO4、草酸(均为分析纯)，甲醇、乙腈(均为色谱纯)，购于重庆永捷实验仪器有限公司；柠檬苦素标准品、抗坏血酸标准品、柠檬酸标准品，均购于成都普瑞法科技开发有限公司；1,1-二苯-2-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，ABAP)、水溶性维生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-teramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)，荧光素二钠，购于上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20高效液相色谱仪、UV-2450紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；FA1004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BPG-9070A精密鼓风干燥箱、HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；SCIENTZ-30ND冷冻干燥设备，宁波新芝生物科技股份有限公司；酶标仪，美国BIO-RAD公司；1.15PK离心机，美国Sigma公司；内切式均质机，宁波新芝生物科技股份有限公司；搅拌机，九阳股份有限公司；人工气候箱，上海凯朗仪器设备厂。

1.3 方法

1.3.1 蜜制柠檬腌制方法

取新鲜柠檬洗净，晾干，切块后放入搅拌机搅碎，取等质量的蜂蜜与柠檬浆混合，用均质机均质5 min。将柠檬蜂蜜混合物分别装入7个已标号的统一规格玻璃罐中，25 ℃恒温恒湿密封腌制，腌制时间分别为0、12、24、48、72、96、120 h，共7次取样进行分析测定。

1.3.2 取样方法

在腌制时间为0、12、24、48、72、96、120 h时分别取样，并将样品真空冷冻干燥，在-20 ℃保存，测定其生化成分、抗氧化能力并对其进行感官评价。

1.3.3 生化成分测定

1.3.3.1 总多酚含量的测定

采用福林酚法，参照GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[6]；

1.3.3.2 VC和柠檬酸含量的测定

称取5 g样品用1%草酸溶液定容至25 mL。将样液在12 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min，上清液过0.45 μm膜，滤液采用高效液相色谱法检测。

色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：A：0.05 mol/L KH2PO4，B：甲醇，VA∶VB=97∶3；柱温：40 ℃；流速：0.4 mL/min；检测波长：254 nm(VC)、210 nm(柠檬酸)；时间：30 min；进样量：10 μL。

1.3.3.3 还原糖含量的测定

采用3,5-二硝基水杨酸比色法，参照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定 3,5-二硝基水杨酸比色法》[7]。

1.3.3.4 柠檬苦素含量的测定

称取5 g样品，加入60%甲醇20 mL，超声30 min，取出，冷却至室温，定容至25 mL，将样液在12 000 r/min、25 ℃离心5 min，上清液过0.45 μm膜，滤液采用高效液相色谱法检测[8]。

色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：A：乙腈，B：水，VA∶VB=45∶55；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；时间：30 min；进样量：10 μL。

1.3.3.5 DPPH自由基清除能力测定

参考并适当修改VIEIRA[9]的方法。将冻干样品稀释成10 mg/mL的溶液，在12 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清液待测。

称取0.1 g DPPH溶于200 mL无水乙醇中，取10 mL稀释于100 mL容量瓶，得到浓度为0.05 mg/mL的DPPH自由基溶液。称取0.1 g VC，用蒸馏水定容于500 mL容量瓶中，分别取0.5、1、2、4、8 mL至10 mL容量瓶中，用纯水定容。

样品溶液的测定按照Ⅰ：2 mL纯水+2 mL DPPH自由基溶液；Ⅱ：2 mL待测液+2 mL DPPH自由基溶液，摇匀后避光反应40 min，在517 nm条件下，用紫外-可见光分光光度计测定吸光度，以50%乙醇溶液作为空白。按照下式计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：AⅠ为Ⅰ管样品吸光度值，AⅡ为Ⅱ管样品吸光度值，AⅢ为空白吸光度值。

以VC为标样，作DPPH自由基清除率—浓度的标准曲线，样品的抗氧化活性用VC当量表示，单位为μg VC/g。

1.3.3.6 ORAC值的测定

参考WOLFE[10]等的方法测定。以pH值为7.4的75 mmol/L磷酸盐缓冲液稀释样品制得样品液。将20 μL空白液、Trolox标准液和样品液点样到底部透明的黑色96孔酶标板上。在37 ℃孵育10 min，然后加入200 μL 0.96 μmol/L荧光素二钠液，继续孵育20 min 并间歇摇动，待酶标板温度达到37 ℃后，迅速加入刚配制的ABAP溶液(119 mmol/L)20 μL以启动反应。在多功能荧光酶标仪中，以激发波长485 nm、发射波长538 nm测定并记录荧光值(fn)，测定时间间隔为4.5 min，连续测定35次，直至荧光衰减至基线。按下式计算荧光衰减曲线下面积(area under the curve，AUC)及保护面积(net area under the curve，net AUC)；根据不同浓度Trolox标准液对应的net AUC得出相应的线性回归方程，根据该方程和所测得样品的net AUC计算出样品的Trolox当量质量摩尔浓度，ORAC值即以μmol Trolox/100g干样品表示。

AUC=(0.5×f1/f1+f2/f1+f3/f1+…+fn/f1+…f34/f1+0.5×f35/f1)×CT

(2)

netAUC=AUCs-AUCb

(3)

式中：f1为第1次荧光读数；fn为第n次荧光读数；循环时间(cycle time，CT)为间隔测定时间4.5 min；AUCs为样品荧光衰减曲线下面积；AUCb为空白试剂荧光衰减曲线下面积。

1.3.4 蜜制柠檬产品感观评价

1.3.4.1 蜜制柠檬产品感观评价标准

参照NY/T 1323—2007《绿色食品 固体饮料》[11]，从色泽、组织形态、滋味与气味、冲调性4个方面建立蜜制柠檬感官评价标准，如表1所示。

1.3.4.2 蜜制柠檬产品感观评价方法

取3 g样品于洁净白瓷器皿中，进行干评，肉眼观察其固体色泽。然后进行湿评，加入150 mL室温饮用水溶解后观察，品尝。

1.3.5 数据处理与分析

数据均采用SPSS 19.0软件进行运算。样本间的差异显著性检验采用Duncan法；相关性分析采用Pearson相关分析法。

2 结果与分析

2.1 蜜制柠檬腌制过程中的生化成分变化

按照柠檬蜂蜜的质量比为1.5∶1、1.2∶1、1∶1、1∶0.7、1∶0.5、1∶0.3分别制作蜜制柠檬。将蜜制柠檬冻干后，质量比为1∶1的样品感官品质较好，冻干样品质量较佳。因此，采用质量比为1∶1制作蜜制柠檬，其腌制过程中的生化成分变化，见表2。

表1 蜜制柠檬感官评价标准

表2 不同腌制时间的蜜制柠檬生化成分比较

注：同一列不同字母表示差异显著(P<0.05)，表5同。

果糖和葡萄糖等还原糖约占蜂蜜水溶性总糖的85% ～ 95%，是蜂蜜中主要的营养成分之一[12]。VC具有防癌抗癌、抗衰老、预防心脑血管病等作用，且在柠檬中含量较高[13]。柠檬酸是柠檬中含量最高的有机酸，是柠檬酸味的重要来源[13]。在蜜制柠檬中，柠檬酸的含量会影响蜜制柠檬整体的酸味；同时，柠檬酸也具有促进消化、消炎、抗病毒、抗癌等功能[13]。柠檬果实中含有的柠檬苦素是苦味来源的主要成分，在腌制过程中，柠檬苦素含量的变化对蜜制柠檬苦味的调节有重要作用[13]。多酚是一类广泛存在于植物和动物产品中的多元酚类化合物，具有防止体内氧化应激，降低癌症、糖尿病、心脑血管等疾病风险的作用[14]；柠檬和蜂蜜中含有丰富的酚类物质，可作为一种重要的膳食抗氧化剂来源[5,15]。在蜜制柠檬中，还原糖、柠檬酸、柠檬苦素分别是形成甜味、酸味、苦味的主要物质，且VC、柠檬酸、柠檬苦素、总多酚是蜜制柠檬中主要的功能成分，对蜜制柠檬的生理功效有重要贡献。

由表2可知，从0 h到120 h的腌制过程中，各时间点的还原糖含量差异不显著。在非发酵性腌制过程中，由于腌制体系中渗透压高、pH值低，因而腌制环境不利于微生物的繁殖生存，与发酵性腌制相比，非发酵性腌制样品中还原糖含量降低速率慢、幅度小[16-18]。美拉德反应是以羰基化合物和氨基化合物为底物，生成一系列深色物质的复杂反应。一方面，腌制体系中的还原糖参与美拉德反应而被消耗；另一方面，在酸性条件下，低聚糖的水解也会使还原糖含量增加[19]。在柠檬蜂蜜腌制体系中，美拉德反应和低聚糖的水解作用可能同时进行，且两种反应的作用效率处于平衡状态，因而腌制过程中的还原糖含量较为稳定。

蜜制柠檬样品腌制0 h时的VC含量较高，为(23.56±0.58) mg/100g。0 h至72 h，VC含量随腌制时间增加而显著下降；72 h至120 h，VC含量较为稳定，变化不显著。VC在腌制加工过程中极易被破坏，且VC的破坏与腌制时间有关[18]。在腌制前期，腌制容器内部的少量空气与蜜制柠檬表面接触，使VC氧化而含量降低。在腌制后期，从72 h至120 h，样品VC含量变化不显著，可能是在此条件下的物质交换已经达到动态平衡，氧化还原反应趋于缓慢，从而形成了稳定的化学物质。

随着腌制时间的增加，柠檬酸含量总体呈下降趋势，但在48 h和96 h时略有上升。与腌制0 h相比，经120 h腌制样品的柠檬酸含量下降了约32.73%。在蜜制柠檬腌制过程中，由于柠檬酸不断降解，其含量总体呈下降趋势，但在其中个别时间点上升，此原因有待进一步研究。

从0 h至120 h，柠檬苦素含量降低约62.78%。从0 h至72 h，柠檬苦素含量呈显著性降低；从72 h至120 h，柠檬苦素含量变化趋于缓慢，各时间点差异性不显著。柠檬苦素是柠檬果实苦味来源的主要成分，较高的柠檬苦素含量会导致果实苦味较重，不适合食用[13]。腌制过程中柠檬苦素含量的降低有利于降低样品的苦味。在腌制过程中，柠檬苦素不断降解，在72 h后趋于稳定。柠檬在经过榨汁、贮藏等加工后一般会产生“后苦现象”，即在酸性条件和柠檬苦素-D-环内酯水解酶的催化下，果实中所存在的非苦味的柠檬苦素-A-环内酯转变成了具有强烈苦味的柠檬苦素[20]。但在腌制加工过程中，样品的柠檬苦素含量随腌制时间的增加呈下降趋势，这种现象可能与腌制体系对相关酶的抑制有关，有待进一步研究。

从0 h至12 h，样品中总多酚含量大幅下降约37.30%，随后总多酚含量随腌制时间增加而缓慢降低；从12 h至48 h，总多酚含量仍显著降低；从48 h至120 h，总多酚含量变化不显著。酚类化合物的化学性质非常活泼，极易氧化成苯醌，苯醌具有强烈的亲电子性，易与亲核基团反应，从而加速其他分子氧化及其自身快速聚合[21]。样品中的多酚含量在0 h至12 h内迅速下降，与罐内的少量氧气导致多酚发生氧化及自身快速聚合有关。多数多酚氧化酶的最适pH值为6～7，pH值在3以下时，酶活性几乎完全失活，当温度在30 ℃以下时，多酚氧化酶的活性也会受到抑制[22-24]。在腌制体系中的pH值较低，温度约为25 ℃，多酚氧化酶的活性被抑制；且腌制体系中存在高浓度电解质，酶也可能失活，因此在腌制后期，总多酚含量下降趋于平缓。

2.2 蜜制柠檬腌制过程中的抗氧化能力评价

2.2.1 蜜制柠檬腌制过程中的抗氧化能力的变化

蜜制柠檬腌制过程中的抗氧化能力变化，见表3。

表3 蜜制柠檬腌制过程中抗氧化能力的变化

注：同一行不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著。

由表3可知，腌制0 h样品的DPPH值为(126.38±1.83)μg VC/g，腌制12 h后的DPPH值下降到(90.17±0.98)μg VC/g。从12 h至120 h，样品随着腌制时间增加而缓慢变化，各时间点的DPPH值的差异不显著。腌制0 h时，样品的DPPH清除率为72.24%，到腌制12 h时，样品的清除率为53.77%，从0 h至12 h样品的清除率下降了18.47%。腌制0 h时，样品的ORAC值为(2 331.14±296.76)μmol Trolox/100g，且随时间的增加而呈下降趋势。从腌制48 h起，样品的ORAC值开始缓慢变化，并且与腌制72、96、120 h的样品相比差异不显著。可以发现，腌制过程会导致蜜制柠檬的抗氧化能力下降，且随着腌制时间的增加而抗氧化能力总体呈下降趋势。可能因为在腌制过程中与抗氧化能力相关的生化成分含量降低，进而导致样品的抗氧化能力减弱。

2.2.2 抗氧化能力与生化成分的相关性分析

生化成分含量的变化可能是导致蜜制柠檬抗氧化能力降低的直接原因，对蜜制柠檬腌制过程中抗氧化能力和主要生化成分进行Pearson相关性分析，详见表4。

表4 蜜制柠檬被检测成分与抗氧化能力之间的相关性

注：*表示相关性显著(P<0.05)；**表示相关性极显著(P<0.01)。

由表4可知，还原糖、VC与两种抗氧化能力评价方法的相关性不显著。陈志娜等[25]报道了新疆野生苹果中VC含量与对DPPH自由基清除能力没有显著相关性，与本实验结果类似。柠檬苦素与ORAC值相关性显著，而与DPPH值相关性不显著，这可能与两种抗氧化能力评价方法的作用原理不同有关。柠檬苦素的抗氧化活性约是VC的2.9 ～ 8.3 倍[26]，淡小艳等研究发现橘皮中柠檬苦素与对DPPH自由基的清除能力相关性不显著[27]。总多酚含量与2种抗氧化能力评价方法的相关性极显著，这与前人的报道相符[14,28]，这也表明总多酚是蜜制柠檬抗氧化活性的重要贡献物质。

2.3 蜜制柠檬腌制过程中的感官品质评价

对腌制过程中的蜜制柠檬进行感官品质评价，结果见表5。

表5 蜜制柠檬的感官评价

注：同一列不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著。

由表5可知，样品的感官评价总分随腌制时间的增加呈先升高后降低的趋势。在48 h时，样品感官评价得分最高；腌制时间为24 h、48 h的样品感观评价总分差异不显著。因此，在0 ～ 120 h，这2个时间点得到的样品品质较优。

由表1、表5可知，样品的色泽(干评)得分随腌制时间的增加而缓慢降低，表明随着腌制时间的增加，样品颜色逐渐加深。此外，随着腌制时间的增加，样品的香气评分呈先上升后下降的趋势，腌制过程中柠檬香和蜂蜜香分别减弱，但两者减弱程度不同，导致两者在整体香气中所占比重不同，这可能是样品香气评分先上升后下降的原因。从样品苦涩味得分来看，随着腌制时间增加，样品苦涩味逐渐降低，苦涩味得分与样品柠檬苦素含量的变化趋势相近；酸甜度得分与还原糖、柠檬酸含量二者的变化趋势不相近，可能是因为酸甜度不仅与酸味、甜味物质的含量有关，也与两类呈味物质的协同或拮抗作用有关。在整个腌制过程中，样品的组织状态没有显著性变化。

3 结论

在常温(25 ℃)下，将柠檬、蜂蜜按质量比1∶1制作，避光腌制0 ～ 120 h。在样品腌制过程中，还原糖含量没有显著变化；柠檬酸含量总体呈下降趋势；总多酚、柠檬苦素、VC含量逐渐下降。与腌制0 h相比，腌制120 h的柠檬酸含量下降了32.73%，VC含量下降了59.21%，柠檬苦素含量下降了62.78%，总多酚含量下降了43.49%。在今后生产加工过程中，可以通过控制腌制时间来达到减少营养、功能成分损失的同时，并适当调节酸、甜、苦味的目的。

采用DPPH法和ORAC法评价样品在腌制过程中抗氧化能力的变化。结果显示，腌制120 h后，样品的DPPH值下降了27.05%，ORAC值下降了20.73%。腌制12 h后，样品的DPPH值变化差异不显著；腌制48 h后，样品的ORAC值没有显著变化。样品的抗氧化能力随腌制时间的增加而总体呈下降趋势，因此，为减少抗氧化能力的损失，可缩短蜜制柠檬的腌制时间。此外，总多酚含量与抗氧化能力呈极显著正相关，即总多酚含量越高，抗氧化能力越强。

感官评价得分随腌制时间的增加呈现先升高再降低的趋势，表明对蜜制柠檬进行一定时间的腌制可以促进其感官品质的提升，但过长的腌制时间则会降低其感官品质。腌制48 h时的样品总分最高，24 h和48 h的样品感官评价得分差异不显著，样品具有良好的色泽、口感和组织形态，且冲调之后样品柠檬香和蜂蜜香浓郁。

腌制时间为24 h和48 h时，所得样品感官品质较佳；而在腌制过程中，样品的功能成分含量和抗氧化能力总体随腌制时间的增加而降低。因此，相对于腌制48 h的蜜制柠檬，腌制24 h的蜜制柠檬不仅具有较佳的感官品质，也尽可能地减少了营养和功能成分的损失。后续可针对蜜制柠檬冻干品的速溶性和冷溶性展开研究，探究影响蜜制柠檬冻干品速溶、冷溶性的因素，并优化制作工艺。

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Effect of curing time on biochemical, sensory and antioxidant characteristics of honey-pickled lemon

LIU Yan1,WANG Jie1,LUO Li-yong1,2,ZENG Liang1,2*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)2(Tea Research Institute, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Reducing sugar, citric acid, limonin, vitamin C and total phenolics of honey-pickled lemon were studied in this paper. DPPH assay and ORAC assay were adopted to evaluate the change of antioxidant activity of honey-pickled lemon during curing. Sensory evaluation to lemon with different pickling time was also designed. The results indicated that the content of reducing honey did not change significantly; the contents of citric acid, limonin, vitamin C and total phenolics decreased significantly by 32.73%, 62.78%, 59.21% and 43.49%, respectively; the antioxidant activity of lemon decreased significantly in early stage of pickling and was stable later; the phenolic content was highly significant correlated with the values of DPPH and ORAC; sensory evaluation scores increased first then decreased along with pickling time; honey-pickled lemon pickled for 48 h had the highest sensory score but was not significantly different from lemon pickled for 24 h.

honey; lemon; pickle; antioxidant; sensory evaluation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705028

本科生(曾亮教授为通讯作者，E-mail：zengliangbaby@126.com)。

国家级大学生创新创业训练计划项目(201510635022)；重庆市现代特色效益农业茶业产业技术体系(编号：2017[6号])

2016-09-13，改回日期：2016-10-08