杨宗统， 李 超， 姜世浩， 于 鹏， 孙 强， 孙军昌，王冬冬， 罗 宁， 王 森， 黄 凯， 王守春， 尹燕博，

(1.青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109 ； 2.青岛博隆实验动物有限公司 ， 山东青岛266225 ；3.青岛海华生物医药技术有限公司 ， 山东青岛266555 ； 4.青岛畜牧科技示范园管委会 ， 山东青岛266200 ； 5.青岛即墨市畜牧兽医局 ， 山东青岛266200 ； 6.青岛澳兰百特生物工程有限公司 ， 山东青岛266101)

犬链球菌和犬源巴氏链球菌的分离鉴定

杨宗统1， 李 超2,3， 姜世浩1， 于 鹏4， 孙 强5， 孙军昌5，王冬冬1， 罗 宁1， 王 森2， 黄 凯2， 王守春6， 尹燕博1，2

(1.青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109 ； 2.青岛博隆实验动物有限公司 ， 山东青岛266225 ；3.青岛海华生物医药技术有限公司 ， 山东青岛266555 ； 4.青岛畜牧科技示范园管委会 ， 山东青岛266200 ； 5.青岛即墨市畜牧兽医局 ， 山东青岛266200 ； 6.青岛澳兰百特生物工程有限公司 ， 山东青岛266101)

为确诊4例送检的表现为咳嗽吐血、猝死犬的病因，采集严重病变的肺脏通过PCR检测犬细小病毒、犬瘟热、犬副流感病毒以及犬腺病毒4种常见病毒；并进行细菌分离，对分离菌进行形态特征观察、染色镜检、生化试验、药敏试验以及16S rRNA基因序列分析。结果显示：病毒检测结果均为阴性，分离到2株犬链球菌及2株巴氏链球菌，2种细菌通过小鼠分别进行人工发病试验，复制出与病死犬相似的病理变化，且从小鼠体内再次分离到这2种细菌，由此确定犬链球菌和巴氏链球菌分离物均为致病菌。养殖场结合药敏试验成功对该病进行了控制。

比格犬 ； 犬链球菌 ； 巴氏链球菌 ； 分离 ； 鉴定

Correspondlng author:YIN Yan-bo

犬链球菌(Streptococcuscanis，S.canis)属于LancefieldG群链球菌，可感染犬、猫、牛等多种动物，偶尔见有感染人的报道[1-2]。1986年Devries等[3]在犬和奶牛乳房炎病料中分离到β溶血性链球菌，被命名为S.canis，并划为β溶血G群链球菌1个新的菌属，模式菌株为DSM20715。S.canis常引起犬呼吸道及泌尿生殖道感染，表现为流产、阴道炎、乳房炎、子宫炎甚至皮肤感染[4]。S.canis感染人可导致败血症、脑膜炎、肺炎、心内膜炎、胸腹膜炎等[5]。Vieira等[6]从犬、猫、貉、狐、貂、小鼠等多种不同动物体内分离到S.canis，并被认为是寄生于动物体内的条件致病菌。当外界条件改变或者机体抵抗力下降，促使S.canis大量增殖并引起发病。

巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)是肠道正常菌群的一部分，以前被称为2型牛链球菌，属于D群链球菌，已多次从人类感染的病例中分离到，且基因型不同于牛链球菌，故新命名为巴氏链球菌。有报道称该菌可导致血友病、乙肝、丙肝和HIV阳性患者出现败血症[7]。到目前为止，在国内尚未见从犬中分离得到巴氏链球菌的报道。

犬科动物是人畜链球菌病的病原携带者[8]，近年来人们对于伴侣动物的情感与日俱增，对于犬细菌病的研究与防控越来越重要。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2016年3-8月门诊共收到4例送检的临床表现为咳嗽、吐血、猝死的病死犬，剖检可见胸腔大量积液，肺脏出血、实变、坏死(见封三图1)。

1.2 实验动物 体重20 g左右健康BALB/c小鼠25只，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.3 主要试剂 血琼脂基础培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、麦康凯琼脂平板，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；细菌药敏试纸片、链球菌细菌生化编码鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；T1克隆载体、Trans-T1感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收纯化试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker 2 000，购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖，购自美国Promega公司；BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；其他试剂材料均由青岛澳兰百特生物工程有限公司诊断中心提供。

1.4 病毒PCR检测 犬细小病病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒以及犬传染性肝炎病毒PCR诊断检测方法为本实验室建立[9]，从病死犬病料分别提取并扩增犬细小病病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒以及犬腺病病毒的核酸，电泳检测有无目标核酸片段。

1.5 细菌分离 取犬病变肺脏组织及胸腔积液，划线接种于鲜血琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(加血清)、麦康凯琼脂平板培养基上分离细菌，于37 ℃恒温培养12～24 h。

1.6 细菌形态特征与培养特性 无菌挑取上述培养基中单个优势菌落，在鲜血琼脂培养基中37 ℃过夜纯化培养，连续传代3次，观察其生长情况并革兰染色镜检，待生长稳定后移接于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)进行纯培养，供鉴定用。

1.7 16S rRNA基因测序分析 使用TRIZol-氯仿-异丙醇法提取分离纯化病原菌的基因组DNA，参考细菌16S rRNA通用引物F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R1492：5′-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3′[10]进行16S rRNA PCR扩增，产物电泳回收后，与T1克隆载体连接，转化到Trans-T1感受态细胞中，经克隆鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果参照卢受昇[11]序列比对的方式，从GenBank数据库中选取不同种的链球菌参考株17株，大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠沙门菌、多杀性巴氏杆菌各1株，将其16S rRNA基因序列用DNAStar软件进行同源性比较并利用MEGA6软件使用最大似然法(Maximum Likelihood)建立系统发育树。

1.8 细菌生化特性鉴定 按说明书进行操作，分别用链球菌细菌生化编码鉴定管GYZ-12St对分离菌进行PYR试剂、糖发酵以及生化试验。

1.9 药敏试验 采用CLSI推荐的纸片扩散法对4株分离菌株进行药物敏感性试验，根据CLSI动物种特异的兽医病原菌抑菌圈直径解释标准[12]进行判定。

1.10 小鼠致病性试验 参照Willianms等[13]的方法，将4株分离物分四组分别腹腔注射5只小鼠，每只0.2 mL(菌液浓度约为109CFU/mL)，另取5只小鼠注射TSB作阴性对照。观察每组发病及死亡情况，从发病死亡小鼠肺脏中重新分离、鉴定细菌。

2 结果

2.1 病毒的PCR检测 犬细小病病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒以及犬腺病病毒4种常见传染病病毒检测结果均为阴性。

2.2 细菌分离结果 从4例送检的犬病变肺脏中各分离到1株细菌，没发现多株菌混感现象。

2.3 细菌培养及染色特性 在鲜血琼脂培养基中生长出淡灰色、透明、圆形、边缘整齐、表面光滑、露珠样小菌落，其中两株呈β型溶血，两株呈α型溶血；在胰蛋白胨培养基上生长较贫瘠，麦康凯琼脂上均不生长。取单菌落分别进行革兰染色，涂片染色镜检可见4株菌形态基本一致，均呈紫红色革兰阳性球菌，可见单个、成对排列，多为3个、4个在一起的短链状或成堆排列。

2.4 PCR鉴定及序列比对结果 通过16S rRNA基因扩增，扩增出1500 bp左右的片段(见图2)。将所测分离株16S rRNA基因序列与参考株基因序列比对分析发现，其中2株分离菌与登录号为KP851852的Streptococcuscanis16S rRNA序列同源性为99%，确认这2株分离菌为犬链球菌，分别命名为S.canis-JM201604、S.canis-JM201608，另外2株分离菌与登录号为KU353617的Streptococcuspasteurianus16S rRNA序列同源性为100%，确认这2株分离菌为巴氏链球菌，分别命名为S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM201607；4株分离菌16S rRNA基因序列在进化树上与17株链球菌参考株同属一支，但序列间存在一定差异；S.canis-JM201604、S.canis-JM201608和S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM201607之间同源性为94.5%，但S.canis-JM201604与S.canis-JM201608同源性为100%，S.pasteurianus-JM201603与S.pasteurianus-JM201607同源性为100%不存在差异；4株分离菌株与大肠杆菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌的同源性差异则较大(见图3)。

2.5 细菌生化特性鉴定 细菌生化鉴定结果：S.canis-JM201604和S.canis-JM201608分离株PYR、精氨酸、蔗糖、海藻糖试验阳性，V-P、GPP、PMG、七叶苷、MAG、TMZ、蕈糖等试验阴性。S.pasteurianus-JM201603和S.pasteurianus-JM201607分离株PMG、七叶苷、MAG、TMZ、蕈糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖试验阳性，PYR、V-P、精氨酸、GPP、马尿酸钠、甘露醇等试验阴性。生化结果见表1。

图2 分离菌16S rRNA PCR扩增结果

M：DNA Marker DL-2 000； 1：分离菌株1扩增产物； 2：分离菌株2扩增产物； 3：分离菌株3扩增产物； 4：分离菌株4扩增产物； 5：阴性对照

图3 16S rRNA序列的系统发育树

表1 分离株生化鉴定结果

2.6 药敏试验结果 结果显示，4株分离菌株均对青霉素，氨苄西林，头孢拉定，氧氟沙星，万古霉素等13种药物敏感；对新霉素、四环素、多西环素、多黏菌素B、呋喃唑酮、克林霉素6种药敏耐药；S.canis-JM201604、S.canis-JM201608对复方新诺明敏感；但S.pasteurianus-JM201603 及S.pasteurianus-JM201607对复方新诺明则耐药。

2.7 动物试验结果 结果显示，4组试验组小鼠在攻毒6 h后开始均出现发病症状，表现为精神不振，食欲减退，扎推并且全身哆嗦，呼吸急促；24 h内S.canis-JM201604注射组死亡4只，S.canis-JM201608注射组死亡5只，S.pasteurianus-JM201603注射组死亡1只，S.pasteurianus-JM201607注射组死亡2只；对照组全部健活。剖检死亡小鼠发现4组试验组病变相似，肺脏出血，脾脏肿大且出血，肠道臌气，肠道壁变薄(见封三图4)。从S.canis-JM201604和S.canis-JM201608攻毒组死亡小鼠肺脏中再次分离到了细菌，鉴定结果为犬链球菌，从S.pasteurianus-JM201603和S.pasteurianus-JM201607攻毒组死亡小鼠肺脏中再次分离到了细菌，鉴定结果为巴氏链球菌，与犬体内分离到的细菌一致。

3 讨论

链球菌是一种人兽共患的革兰阳性球菌，多数呈α溶血或β溶血，多糖抗原的不同可将链球菌分成20个群，引起人发病的链球菌以A群为主，C、D、F、L群可引起猪、牛、羊发病。S.canis属于G群链球菌，呈β溶血，可引起犬、猫、貉、狐、貂、小鼠等多种不同动物发病，此外还可以感染人引发疾病[4,14]。Hassan报道从许多不同动物体内分离到S.canis，常寄生于动物体内的消化道、生殖道等，是一种条件致病菌。S.canis可以通过不同的传播途径给动物造成感染，引起动物机体不同的病理变化[15]。S.pasteurianus属于D群链球菌，呈α溶血，在免疫功能低下患者中可以导致出现败血症，通常情况下也与胃肠道疾病有关[7]。细菌在犬的肺炎、皮肤病、化脓创等病程中起着关键的作用[16]。

本试验从病原学角度对这4例肺炎患病比格犬的病因进行了探究和分析，经PCR检测，排除了犬瘟热病毒、犬细小病病毒、犬副流感病毒以及犬传染性肝炎病病毒感染的可能。从患病犬病变肺脏中分别分离出2株犬链球菌和两株巴氏链球菌，并进行了相关鉴定。药敏试验显示，青霉素，氨苄西林，头孢拉定，氧氟沙星，万古霉素等13种药物对4株分离菌均敏感。

致病性试验表明，S.canis-JM201604、S.canis-JM201608、S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM2016074株分离菌对小鼠均有一定的致病性，当外界条件改变或者机体抵抗力下降可能引起发病，犬链球菌和巴氏链球菌均为动物体内的条件致病菌，但是S.canis-JM201604、S.canis-JM201608分离株致病力高于S.pasteurianus-JM201603、S.pasteurianus-JM201607分离株，S.pasteurianus-JM201603和S.pasteurianus-JM201607分离株致死率较低。

养殖场应根据犬链球菌和巴氏链球菌的流行特点，改善环境卫生条件，提高机体抵抗力来抗御病原菌的攻击，根据药敏结果合理使用青霉素，氨苄西林，头孢拉定，氧氟沙星，万古霉素等13种敏感药物进行预防与治疗，从而控制相应感染的发生。

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Isolation and Identification ofStreptococcusCanisandStreptococcusPasteurianusin canines

YANG Zong-tong1, LI Chao2,3, JIANG Shi-hao1, YU Peng4, SUN Qiang5, SUN Jun-chang5, WANG Dong-dong1, LUO Ning1, WANG Sen2, HUANG Kai2, WANG Shou-chun6, YIN Yan-bo1,2

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University， Qingdao 266019, China;2.Qingdao Bolong Laboratory Animal Co., LTD., Qingdao 266225, China；3.Qingdao Haihua Biomedicine Technical Co., LTD., Qingdao 266555, China;4.Qingdao Animal Husbandry Park, Qingdao 266200, China；5.Jimo Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Qingdao 266200, China；6.Qingdao Oland-Better Bioengineering Co., LTD., Qingdao 266101, China)

To find the cause of the disease of four cases of dogs with cough, vomiting and sudden death, CPV, CDV, CPIV and CAV were detected by PCR and bacteria were isolated from lungs. The morphological characteristics, staining microscopic examination, biochemical test and drug sensitivity test were conducted, and sequence analysis on 16S rRNA gene were compared between the isolates and reference strain. The results showed that the four viruses were negative by PCR, and four strains of pathogenic bacteria (two strains ofStreptococcuscanisand two strains ofStreptococcusPasteurianus) were isolated from the lungs. Through the artificial challenge test in mice, the two strains of bacteria could replicate and cause pathological changes similar to those in beagles, and the two strains of bacteria were isolated from the mice in vivo. It was concluded that theStreptococcuscanisstrain and theStreptococcuspasteurianusstrain were both determined as the pathogens of the four cases. This disease was successfully controlled by using suggested medicine according to result of the drug sensitivity test in this farm.

beagle dog ;Streptococcuscanis;Streptococcuspasteurianus; isolation ; identification

2016-12-29

杨宗统(1992-)，男，硕士生，主要从事基础兽医学研究,E-mail:18724743813@139.com

尹燕博，E-mail:yanboyin2011@163.com

S855.1+1

A

0529-6005(2017)05-0078-04