高见勋 ， 黄廷贺 ， 葛伯洋 ， 樊兆斌

(1.辽宁益康生物股份有限公司 ， 辽宁辽阳111000 ; 2.菏泽学院药物科学与技术系 ， 山东菏泽274000)

1株野鸟源重组H3N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析

高见勋1， 黄廷贺1， 葛伯洋1， 樊兆斌2

(1.辽宁益康生物股份有限公司 ， 辽宁辽阳111000 ; 2.菏泽学院药物科学与技术系 ， 山东菏泽274000)

2014年4月-6月期间，在辽宁盘锦湿地采集野鸭泄殖腔拭子98份，分离到1株H3N2亚型禽流感病毒。作者对其进行了全基因组测序及HA和NA基因遗传进化分析。HA基因遗传进化树分为4个分支，分离株属于Avian分支，与Canine分支有较近的遗传关系，共同聚到一个大分支，与Equine分支遗传距离最远。NA基因遗传演化表明，分离株属于亚洲分支。

H3N2亚型 ； 分子特征 ； 遗传进化

H3N2禽流感病毒是A型流感病毒中的一个重要亚型。1968年7月中旬暴发的 “香港流感”，8至9月间经香港迅速传播，引发全球大流行，导致近达到100万人死亡，经查证此次流感大流行的“元凶”为H3N2流感病毒[1]。近些年该亚型病毒在全球大多数国家人流感流行病学监测结果中显示为优势毒株。该亚型流感病毒在猪群中主要为类人和基因重排H3N2两种流行株[2]。近年，在自然及人为选择双重压力下，该亚型病毒跨越种间传播的机率也在逐步的加大，如2007年韩国和2010年中国广东都报道了H3N2禽流感感染犬的病例，而且韩国出现了犬源H3N2病毒感染家猫的跨种间传播[3-4]。野鸟作为禽流感病毒的天然宿主，为流感病毒的抗原变异提供了良好条件，作者对辽宁盘锦湿地1株野鸟源H3N2病毒全基因组进行了分析，旨在为禽流感病毒的疾病预测提供流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 病毒 2014年4月-6月，辽宁盘锦湿地采集野鸭泄殖腔拭子98份，分离到1株H3N2禽流感病毒，命名为：A/Mallard/Liaoning/1/2014(H3N2)，简称MD/LN/1/14。

1.2 病毒的分离及鉴定 病毒的分离与纯化采用SPF鸡胚系统，具有参考文献[5]方法。参照禽流感诊断标准的HA-HI方法，使用H1～H16亚型禽流感及新城疫的标准血清初步判定病毒的亚型。以上病毒的分离都在辽宁益康生物股份有限公司P2实验室完成。

1.3 病毒全基因组序列测定及遗传进化分析 用TRIZol LS试剂盒从阳性鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，反转录合成cDNA后进行RT-PCR扩增，之后将纯化的PCR产物后克隆到pGEMT-EASY载体上，阳性质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。用DNA STAR中的SeqMan对测序结果进行拼接，用BLAST工具进行同源序列搜索，用MEGA5.0软件进行多序列比对分析以及系统进化树的构建。

2 结果与分析

2.1 同源性比较 利用NCBI中的BLAST软件搜索发现，分离株的8个基因片段与8株不同亚型的禽流感病毒同源性最高，属于新的重组病毒。结果见表1。

表1 MD/LN/1/14基因片段同源性分析

2.2 分子特征分析

2.2.1 HA分子特征分析 分离株HA蛋白序列分析表明，HA蛋白裂解位点为PEKQTR*GLF，具有低致病性禽流感的特征。分离株HA蛋白有6个潜在的糖基化位点，其与SW/GD/01/98、Moscow/10/99毒株的差异见表2。影响流感病毒受体结合特异性的关键位点为226，228[6]，分离株两个位点的氨基酸分别为Gln，Gly，仍保持优先结合SA-α-2,3-Gal受体的特性，不具备跨种传播的能力。结果见表4。

表2 HA蛋白潜在糖基化位点分析

DK/GX/69/09：A/duck/Guangxi/69/2009(H3N8)；SW/GD/01/98：A/swine/Guangdong/01/1998(H3N2)；Moscow/10/99：A/Moscow/10/1999(H3N2)

2.2.2 NA分子特征分析 野鸭源MD/LN/1/14有6个糖基化位点，与DK/China/92/09、Moscow/10/99，SW/GD/01/98毒株比较结果见表3。分离株NA分子中与流感病毒抗达菲类药物相关的275(H-Y)氨基酸位点没有发现突变[7]。结果见表4。

表3 NA蛋白潜在糖基化位点分析

2.2.3 其他基因分子特征分析 PB2分子的627位点和701位点被认为在流感病毒跨种间传播中起关键性作用[8-9]，分离株两个位点均末发生突变。分离株M2分子与抗金刚烷胺类药物相关氨基酸位点没有突变[9]。NS1分子的92位点氨基酸由Asp突变为Glu，可以导致流感病毒对干扰素产生抗性[10]，分离株末检测到突变。结果见表4。

2.3 HA和NA基因分子进化分析 将分离的MD/LN/1/14毒株，与不同宿主来源、不同区域的代表株及GenBank中搜索的同源性较高的毒株进行分析，构建了HA和NA基因遗传进化树。从图1-A可知，HA基因分为4个分支，MD/LN/1/14分离株聚类到Avian分支。此分支与Canine分支具有较近的遗传距离，共同聚到同一个大分支，与Equine分支的遗传距离则最远。从图1-B可知，NA基因遗传进化树划分成亚洲和欧洲两大分支，MD/LN/1/14分离株聚类到亚洲分支，该分支核苷酸同源率在87%～96%范围内。

表4 关键位点的突变分析

图1 基于HA基因(A)和NA(B)基因开放阅读框构建的遗传进化树

3 讨论

流感病毒HA分子的可裂解性在禽流感病毒组织嗜性及致病性方面起着关键作用[11]。MD/LN/1/14病毒HA蛋白裂解位点为PEKQTR*GLF，与禽源、人源及猪源相同。马流感则为PEKQIR*GLF，其与Crawford等在2005年分离到的犬源H3N2流感病毒相同，而2009-2010年分离的H3N2亚型犬流感病毒则为PERQTR*GLF，我国广东分离的1株犬流感却与禽源H3亚型流感病毒裂解位点相同[12]。因此，HA蛋白裂解位点T328R和K326R的突变在H3亚型流感病毒宿主特异性方面需进一步研究证实。

MD/LN/1/14毒株HA分子有6个潜在糖基化位点，而SW/GD/01/98 和Moscow/10/99分别有7个和9个。谢剑锋对1996-2011年福建省H3N2亚型流感病毒分子特征分析中发现，HA蛋白糖基化位点有随着时间的推移逐渐增加的趋势，这可能是病毒为了逃逸宿主免疫屏障的压力而发生的抗原漂移[13]。野鸟由于其特殊的行为和生活习性，以及不存在接种疫苗的原因，这可能是导致其糖基化位点较少的一个重要原因。NA蛋白中与流感病毒抗达菲类药物相关的氨基酸位点的突变在分离株中均未检测到，这可能与野鸟不接触抗病毒类药物有关。

HA基因系统进化分析发现，分离株划归于Avian分支，主要为分离于水禽的H3亚型禽流感病毒，分布于东亚，欧洲及西伯利亚等地域。Avian分支与Canine分支遗传关系较近，与Equine分支遗传关系较远。分析我国广东分离的犬源H3N2亚型HA氨基酸序列，发现其耐药性，关键性受体结合位点及与致病性相关的位点同禽源保持较高度一致，却与猪源、马源及人源表现出较大的不同，这表明我国2010-2011年间流行的H3N2亚型犬流感，可能是犬与家禽接触过程中或者食用生禽肉次感染了该病毒，此与Song等研究的韩国犬猫源H3N2亚型病毒可能来自于鸟类的分析结果一致。因此，我们需要加大我国野鸟、家禽及犬H3亚型禽流感病毒的监察力度，及时掌握禽流感病毒的遗传变异规律，为进一步加强防控H3亚型禽流感病毒跨越种间传播提供充足的数据基础。

[1] 杜宁,杨霄星,蓝雨,等.1968 年香港流感(H3N2)病原学概述[J].病毒学报,2009,25(5):17-20.

[2] Olsen C W,Karasin A I,Carman S,etal. Triple reassortant H3N2 influenza A viruses,Canada,2005[J].Emerging infectious diseases,2006,12(7):1132.

[3] Song D,Kang B,Lee C,etal. Transmission of avian influenza virus (H3N2) to dogs[J]. Emerging infectious diseases,2008,14(5)：741.

[4] Lin Y,Zhao Y,Zeng X,etal. Genetic and pathobiologic characterization of H3N2 canine influenza viruses isolated in the Jiangsu Province of China in 2009-2010[J]. Veterinary microbiology,2012,158(3):247-258.

[5] 郭元吉,程小雯.流行性感冒病毒及其试验技术[M]. 北京:中国三峡出版社,1997：87-90.

[6] Yamada S,Suzuki,Y，Suzuki T,etal. Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors[J]. Nature,2006,444,378-382.

[7] Brookes S M,Irvine R M,Nunez A,etal. Influenza A (H1N1) infection in pigs[J]. Veterinary Record,2009,164(24): 760-761.

[8] Katz J M,Lu X,Tumpey T M,etal. Molecular correlates of influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice[J]. Journal of virology,2000,74(22):10807-10810.

[9] Li Z,Chen H,Jiao P,etal.Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model[J]. Journal of virology,2005,79(18):12058-12064.

[10] Li S,Shi Z,Jiao P,etal. Avian-origin H3N2 canine influenza A viruses in Southern China[J]. Infection,Genetics and Evolution,2010,10(8): 1286-1288.

[11] 曹梅,田夫林,庄文忠.禽流感病毒血凝素分子生物学研究进展[J].动物医学进展,2004,25(2): 35-37.

[12] 余利旋,熊永忠,远立国,等.H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,2011,33(001):15-18.

[13] 谢剑锋.福建省H3N2亚型流感病毒分子流行病学特征分析[D].福州：福建医科大学，2012.

Phylogenetic Analyses of a Novel H3N2 Avian Influenza Virus Isolated from a Mallard

GAO Jian-xun1, HUANG Ting-he1, GE Bo-yang1, FAN Zhao-bin2

(1.Yi Kang Biotechnology co., LTD of Liao Ning, Liaoyang 111000, China; 2.Department of Pharmaceutical Science and Technology, Heze 274000, China)

From April to June 2014,98 cloaca samples were collected from mallard in wetland of Panjin,Liaoning province,and a novel H3N2 strain AIV was isolated. The complete gene sequences and phylogenetic analyses were performed. The HA Phylogenetic tree was divided into four lineages and the isolate belonged to Avian lineage. This lineage had the shortest genetic distance from canine lineage,but a further distance from equine lineage. The isolate fell into Asian lineage in the NA phylogenetic tree.

H3N2 subtype ; molecular characterization ; genetic evolution

FAN Zhao-bin

2016-08-30

国家自然科学基金青年基金项目(31402170)；辽宁科技厅自然科学基金项目(2014022045)

高见勋(1985-)，男，本科生，就读于动物病毒分子生物学专业，E-mail：438321212@qq.com

樊兆斌，E-mail：18724591358@163.com

S858.31

A

0529-6005(2017)05-0012-03