卢 柳 ， 张 军 ， 周碧君 ， 张 旭 ， 赵梦婕 ， 何 娜 ， 王开功 ， 文 明 ， 张 海

(1.贵州大学动物科学学院 ， 贵州贵阳550025； 2.贵州省六盘水市动物卫生监督所 ， 贵州六盘水553001)

牛乳头状瘤病诊断及其病毒基因型分析

卢 柳1， 张 军2， 周碧君1， 张 旭1， 赵梦婕1， 何 娜1， 王开功1， 文 明1， 张 海1

(1.贵州大学动物科学学院 ， 贵州贵阳550025； 2.贵州省六盘水市动物卫生监督所 ， 贵州六盘水553001)

对贵州省晴隆县某种牛场暴发的疑似牛乳头状肿瘤病进行诊断，采用流行病学调查、临床症状观察、病理切片观察、PCR检测和分子分型。结果显示，该种牛场牛乳头状瘤病发病率为35%(7/20)。瘤体多呈结节状及菜花状，颜色多呈灰白色。病理切片显示，瘤体呈现角质化过度和细胞空泡化现象。遗传进化树分析显示，贵州省晴隆县暴发的牛乳头状肿瘤病是由BPV2型牛乳头瘤病毒所引起。本研究为贵州地区牛乳头状瘤病的科学防控提供了一定的理论依据。

牛乳头状瘤 ； 诊断 ； 基因型分析

牛乳头状瘤病是由牛乳头瘤病毒(Bovinepapillamavirus,BPV)引起的一种皮肤或部分黏膜发生的慢性增生性传染性疾病，也称为“牛疣”[1]。牛乳头状瘤病于1929年被首次报道之后，现在在世界各地都广泛流行并传播，加拿大、澳大利亚、英国、美国和德国等均有该病的报道[2]。近两年在我国新疆、东北和海南地区也有该病的报道[3-4]。牛乳头状瘤病是牛常见的良性肿瘤疾病，但严重时瘤体会由良性变成恶性肿瘤而引起家畜的死亡，因此会给养牛场带来巨大的经济损失。根据最新报道，BPV可分为14个基因型[5]，不同基因型的病毒可以引起不同部位的病理变化，且BPV具有很强的种属特异性，很难感染除宿主以外的其他动物[6-7].

近年来，贵州省不断从其他地方引进优良品种牛，牛养殖规模不断扩大，在发展养牛业的同时也带来了本地区未发生过的疾病。2016年1月晴隆县某种牛场暴发疑似牛乳头状瘤病，通过对该种牛场进行流行病学调查，临床观察、对疑似病料进行了病理观察、PCR检测和分子分型，为该病在贵州省的科学防控提供了一定指导。

1 材料

1.1 病料 贵州省晴隆县某种牛场患病种牛经临床诊断，外科手术摘除病牛体表的乳头样肿瘤物，送至贵州大学动物科学学院动物疫病研究所保存。

1.2 主要试剂 2×TaqPCR Master Mix、DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；载体pMD19-T，购自TaKaRa公司；DL-2 000 DNA Marker，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；DH5α感受态细胞由贵州大学动物疫病研究所保存。

2 方法

2.1 流行病学及临床症状调查 调查种牛场的养殖规模，种牛品种，牛乳头状瘤发病率、死亡率；牛乳头状瘤形状、大小以及发病部位等。2.2 病理组织学检查 观察发病种牛的乳头样肿瘤物形态特征，取皮肤肿瘤样物经4%多聚甲醛溶液中固定，制作病理切片，光镜观察组织病理学变化。

2.3 引物设计 参考GenBank公布的各型BPV L1基因序列，设计1对引物P1：5′-ATGGCGTTGTGGCAACAAG-3′，P2：5′-TTAAGCTTTGATTTTTTTTC-3′，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

2.4 PCR扩增产物检测 通过引物P1/P2对奶牛病变皮肤进行PCR检测，反应采用25 μL体系，反应体系为：2xTaqPCR Maeter Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL，用灭菌双蒸水补足体积至25 μL。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 基因序列测定与分子分型 将克隆的阳性质粒，送上海英潍捷基生物技术有限公司进行序列测定。利用DNAStar等软件对BPV晴隆株和GenBank登录的BPV不同型的流行基因序列进行比对分析，用MEGA5.0软件进行同源性分析，并采用NJ法构建系统进化树。

3 结果与分析

3.1 流行病学调查和临床症状观察 该种牛场2015年12月向澳大利亚引进的安格斯种牛，牛乳头状肿瘤病发病率为35%(7/20)，无病牛死亡。临床观察发现牛乳头状肿瘤多发生在面部、眼睛周围、颈部等位置。严重病例在面部、颈部均能见到大面积乳头状瘤状物，瘤体间单独或者连成一片生长。瘤体多呈菜花状，颜色呈灰白色，表面光滑或粗糙、质地坚硬。

3.2 病理组织学切片结果 对皮肤肿瘤样物病理组织切片，经H.E.染色镜检显示，表皮与真皮增生；肿瘤细胞呈梭形或星型，核呈卵圆形；表皮细胞呈现过度角质化和部分颗粒细胞空泡化的现象，结果见中插彩版图1A和1B。3.3 PCR检测结果 牛乳头状瘤疑似病料中，PCR检测阳性样品，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，所扩增的目的PCR产物的大小约1 494 bp，结果见图2。

图2 牛乳头状瘤疑似病料PCR产物电泳检测结果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1～3：扩增结果； —：阴性对照

3.4 BPV L1基因核苷酸序列同源性分析 将本实验克隆的L1基因(命名为BPV-QL1)与GenBank上公布的16株BPV各型的L1基因的对应序列进行比对分析，结果显示,贵州省晴隆流行株与BPV2、BPV2-SW01和BPV2-AKS01参考株的核苷酸同源性分别为99.1%、99.9%、99.4%，同时与BPV13参考株、BPV1参考株的核苷酸同源性也达88.8%、84.4%，结果见图3。

3.5 BPV L1 基因遗传进化树分析 L1基因是BPV基因组中比较保守的衣壳蛋白，通常用于各型病毒之间的基因分型。将各型BPV的L1基因序列进行对比分析，并采用NJ法(Neighbor-JingMethod)构建BPV系统进化树(图4)。经DNAStar分析表明，BPV-GZ01与BPV2处于同一遗传进化分支，所以BPV-QL1属于2型牛乳头瘤病毒，且与BPV-1、BPV-13亲缘关系比较接近。

4 讨论

牛乳头状瘤病毒(BPV)属于乳多空病毒(papovavirus)科乳头状病毒属[10]的一种双链DNA病毒，已报道有14个基因型，还有很多假定基因型。在本研究中，根据牛的临床症状[8-9]查阅相关资料，针对BPV L1保守序列设计特异性引物进行PCR扩增，克隆测序后与报道的牛乳头状瘤病毒14个基因型进行同源性和遗传进化树分析，证实该牛场发生的牛乳头状瘤病为2型牛乳头瘤病毒感染。临床观察牛乳头状瘤为灰白色，菜花状，质地坚硬，表面略有粗糙。病理组织学观察发现牛乳头状瘤有过度角质化和部分颗粒细胞的空泡化现象。

图3 BPV-QL1株与BPV不同基因型的L1基因核苷酸序列比较BPV1(X02346)、BPV2(M20219)、BPV2-SW01(KC878306)、BPV2-AKS01(KM455051)、BPV3(AF486184)、BPV4(X05817)、BPV5(AF457465)、BPV6(AJ620208)、BPV7(DQ217793)、BPV8(DQ098913)、BPV9(AB331650)、BPV10(AB331651)、BPV11(AB543507)、BPV12(JF834523)、BPV13(JQ798171)、BPV14(KP276343)

图4 L1基因序列构建的不同基因型BPV系统进化树

发病牛和健康牛群居是导致牛之间互相感染牛乳头状瘤病毒的主要原因。该病一般呈良性经过，死亡率不高，但康复时间比较长，可用手术方法摘除瘤体，术后及时护理，并加强饲养管理，及时隔离病牛等措施进行预防和治疗。

近两年贵州省大力发展养牛业，从国外和省外引进了优质的种牛，同时许多外来疾病也随之带入，从而威胁着贵州省养牛业的发展，给养牛业带来巨大的挑战。此次诊断为贵州地区外来疾病的科学防控提供了一定的理论依据。

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Diagnosis of Bovine Papilloma and the Virus Genetyppe Analysis

LU Liu1， ZHANG Jun1， ZHOU Bi-jun1， ZHANG Xu1， ZHAO Meng-jie1， HE Na1，WANG Kai-gong1， WEN Ming1， ZHANG Hai1

(1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2.Animal Health Supervision Institute of Liupanshui City， Liupanshui 553001， China)

The purpose of this study was to diagnose the outbreak of suspected cattle papillary tumor in a cattle farm in Qinglong County in Guizhou province by the epidemiological investigation, clinical symptoms, pathological observation, PCR molecular detection and molecular typing. The results showed that the cattle farm bovine papilloma incidence rate was 35% (7/20). The tumor was nodular and cauliflower, and the color was gray. Pathological section showed that the tumor body had the phenomenon of stratum corneum and vacuole. Genetic evolutionary tree analysis showed that the outbreak of bovine papillary tumor in Qinglong County, Guizhou province was caused by the BPV2 type of bovine papilloma virus. This study provides a theoretical basis for the scientific prevention and control of bovine papilloma in Guizhou area.

Bovine papilloma ; diagnosis ; genotype analysis

ZHOU Bi-jun

2016-11-15

贵州省黔南州社会发展科技重大计划项目《喀斯特石漠化林草牧综合治理技术研究与示范》[黔南社发科(20140325)]；贵州现代肉牛产业技术体系专项(GZCYTX2015-0302-02)；贵州省农业委员会科技专项《动物疫病防控能力提升专项》(黔农财[2015]149号)；“贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生保障科技创新人才团队”(黔科合人才团队[2015]4016号);贵州省农业委员会科技计划项目 [2016-01号]；贵州大学大学生“SRT”计划项目(贵大SRT字(2015)094号)

卢柳(1994-)，女，本科生，就读于动物医学专业，E-mail:15761632703@163.com

周碧君，E-mail:zhoubijungzu@eyou.com

S852.65+3

A

0529-6005(2017)05-0009-03