赵世颖 ， 马志军 ， 冯金玲 ， 徐 阳 ， 徐美玉 ， 秦玉成 ， 吴德国 ， 张国中1,

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193 ； 2.中国科学院遗传与发育生物学研究所 ， 北京朝阳100101 ；3.北京市动物疫病预防控制中心 ， 北京朝阳102629 ； 4.中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心 ， 北京海淀100193 ；5.北京市平谷区动物卫生监督所 ， 北京平谷101200)

1例鸡传染性鼻炎的诊断与分析

赵世颖1,2， 马志军3， 冯金玲4， 徐 阳4， 徐美玉4， 秦玉成5， 吴德国2， 张国中1,4

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193 ； 2.中国科学院遗传与发育生物学研究所 ， 北京朝阳100101 ；3.北京市动物疫病预防控制中心 ， 北京朝阳102629 ； 4.中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心 ， 北京海淀100193 ；5.北京市平谷区动物卫生监督所 ， 北京平谷101200)

本研究对北京某鸡场发生的1例鸡传染性鼻炎疑似病例进行了诊断和分析。PCR检测和测序分析结果显示，该鸡群存在副鸡禽杆菌感染。分离菌株经染色镜检、生化鉴定和致病性试验鉴定为副鸡禽杆菌，将纯培养获得的菌株命名为PGSY株。血凝素基因测序比对结果显示，副鸡禽杆菌PGSY株血凝素基因长度为1 008 bp，与SD-1株的核苷酸同源性高达99%。但PGSY株血凝素基因序列较SD-1株缺失了30个碱基。遗传进化树分析显示，该菌株与国内分离株SD-1属于同一进化分支。

副鸡禽杆菌 ； 分离鉴定 ； 序列分析

鸡传染性鼻炎(Infectious Coryza)是由副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum)引起的一种急性呼吸道疾病。该病可导致产蛋鸡产蛋明显下降，可并发感染其他疾病，给养鸡业造成严重的经济损失。1987年，冯文达在北京首先分离到这一菌株[1]。近几年鸡传染性鼻炎在我国又呈多发趋势，且出现了新的流行特点[2]。该病的病原在2005年之前被称为副鸡嗜血杆菌，后更名为副鸡禽杆菌[3]。本研究对北京某鸡场一例鸡传染性鼻炎疑似病例进行了系统的检测与分析。

1 材料与方法

1.1 病料 来源于北京市某商品蛋鸡养殖场，送检病鸡为165日龄。临床表现发呆、拉绿色稀粪、打呼噜、眼睑肿胀，产蛋率从91%降到85%。无菌采集病鸡眶下窦黏液用于实验室检验与分析。

1.2 鸡胚和实验动物 SPF鸡胚和6周龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3 培养基和主要试剂 羊血琼脂培养基、半合成液体培养基、半合成固体培养基由本实验室制备[4]。

1.4 PCR鉴定 以眶下窦分泌物提取的基因组DNA为模板，利用针对副鸡禽杆菌血凝素基因的引物进行检测，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物(5′-3′)：TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT，下游引物(5′-3′)：CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT。在灭菌的0.2 mL PCR管中加入3 μL模板cDNA，0.5 μL上游引物(20 μmol/L)，0.5 μL下游引物(20 μmol/L)，10 μL PCR Mix，6 μL ddH2O。PCR扩增程序为94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72 ℃30 s，循环30次，72 ℃10 min循环1次，扩增500 bp的目的序列。PCR产物进行1%琼脂糖电泳。对阳性样品进行测序分析。

1.5 细菌的分离培养 用眶下窦内容物划线接种于羊血琼脂平板，再用金黄色葡萄球菌做井字划线，37 ℃厌氧培养24 h～48 h。挑取单个可疑菌落接种到半合成固体培养基上，在37 ℃厌氧环境进行纯培养48 h，有针尖大小菌落长出后，挑取单菌落进行革兰染色镜检，在光学显微镜下观察细菌形态。并挑取单个菌落接种于半合成液体培养基，于振荡箱37 ℃培养震荡48 h用于下一步鉴定。

1.6 生化试验 将振荡培养的细菌悬液，接种于细菌生化微量鉴定管中，再在每只鉴定管中加入终浓度为40 μg/mL的NADH，置于5%CO2培养箱37 ℃培养。观察细菌的生化特性，生化鉴定结果判定方法按照细菌生化微量鉴定管使用说明书进行。1.7 致病性试验 将30只6周龄的SPF鸡随机分为2组。攻毒组15只鸡经眶下窦内注射3.4×107CFU/0.2mL/只的菌液，对照组15只鸡注射0.2 mL/只的液体培养基，攻毒后记录发病情况[5-6]，并再次取眶下窦分泌物进行PCR检测和细菌分离培养。

1.8 血凝素基因测序分析 挑取单菌落按试剂盒操作说明书提取菌株DNA作为模板，采用卢冷轶设计的引物对[7]，来扩增包含完整血凝素基因的DNA片段。反应体系中加入3 μL模板cDNA，0.5 μL上游引物(20 μmol/L)，0.5 μL下游引物(20 μmol/L)，10 μL PCR Mix，6 μL ddH2O扩增程序为94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循环30次，72 ℃ 10 min循环1次。取产物5 μL利用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将纯化回收后的产物与pMD18-T Easy载体连接，提取质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果与GenBank上发表的其他的副鸡禽杆菌血凝素基因核苷酸序列进行比较分析。

1.9 分离株血凝素基因遗传进化分析 应用MEGA4.0分析软件进行遗传进化分析，将测定的序列与GenBank上下载的其他序列一起绘制遗传进化树[8]。

2 结果

2.1 PCR鉴定 送检病料与阳性对照均在500 bp位置处出现了与预期大小相一致的DNA条带，阴性对照未扩增出任何片段，表明病鸡存在副鸡禽杆菌感染，如图1所示。对阳性样品血凝素基因(hemagglutinin antigen gene)进行序列测定，测序结果进行NCBI BLAST比对，结果显示与副鸡禽杆菌同源性最高。

图1 送检病料PCR检测结果

M:DNA Marker； P:阳性对照； N:阴性对照； 1:送检病料

2.2 细菌的分离和培养 在羊血琼脂平板上厌氧培养48 h后，葡萄球菌周围形成针尖样大小的菌落，离葡萄球菌越近菌落越大，呈现“卫星现象”，如图2所示。在半合成固体培养基上，形成半透明、细小的露滴样菌落，菌落圆润、光滑、边缘整齐。

图2 在羊血琼脂平板上形成的“卫星现象”

2.3 革兰染色镜检 镜检发现该分离菌株为革兰阴性短杆菌或球杆菌，呈现单个、成双或短链的分散均匀排列，两极浓染，符合副鸡禽杆菌的染色特征。

2.4 生化鉴定 生化鉴定结果如表1所示，与副鸡禽杆菌的生化特性相符。

表1 分离株的生化特性

+：生化试验阳性，发酵糖，产酸；-：生化试验阴性，不发酵糖，不产酸

2.5 对鸡的致病性 攻毒48 h后，攻毒组发病率为93.3%(14/15)；对照组鸡只均无明显症状。发病鸡只全部出现眶下窦肿胀，其中92.9%(13/14)流鼻汁。攻毒后1～4 d发病鸡眶下窦肿胀明显，流鼻汁较多，到10 d症状消失，没有出现死亡。攻毒组鸡PCR检测阳性率为53.3%(8/15)，并再次分离到了副鸡禽杆菌。2.6 血凝素基因的序列测定与分析 分离株血凝素基因的PCR扩增结果如图3所示，与预期片段大小相符为1 100 bp。序列测定显示，分离株的血凝素基因长为1 008 bp，编码335个氨基酸，命名为副鸡禽杆菌PGSY株。将PGSY株的血凝素基因序列与NCBI下载的47个副鸡禽杆菌血凝素基因序列进行核苷酸序列同源性比对，同源性在93.4%到99.0%之间。PGSY株与国内分离株SD-1、Tianjin的同源性最高达到99.0%，与A型参考株221(疫苗株)同源性为95.7%，与B型参考株0222同源性为95.7%，与C型参考株Modesto(疫苗株)同源性为94.4%，与印度分离株VRDCAvpgCCSZ的同源性最低为93.4%。

图3 血凝素基因的PCR扩增结果

2.7 核苷酸变异分析 PGSY株与SD-1有着很高的相似性，但其序列长度有所不同，PGSY株核苷酸序列比已知的SD-1株缺失了30个碱基(即10个氨基酸位点)，比A型参考株221缺失了27个碱基(图4)。

图4 血凝素基因核苷酸序列对比﹣：核苷酸缺失

2.8 血凝素基因遗传进化分析 PGSY株与两个国内分离株SD-1，Tianjin和印度分离株VRDCAvpgHC5SZ同属一个新的进化支，与参考株221(A型)、0222(B型)、Modesto(C型)亲缘关系较远，处于不同进化分支，如图5所示。

3 讨论

鸡传染性鼻炎是养鸡生产中的一类重要疫病，近年发生有增加的趋势。由于大型养殖场都对该病进行了免疫，所以容易误诊或延误确诊治疗时间。该副鸡禽杆菌分离株经北京市农林科学院鉴定血清型为A型，发病鸡群免疫过某公司生产的鸡传染性鼻炎二价灭活疫苗(A型+C型)，但是鸡群仍然发病。这种现象时有发生，养殖户通常认为是免疫程序操作不规范或疫苗质量问题所致，而忽视了菌株本身可能发生变异的原因，由于对该病原的研究并不全面，所以在防治过程中仍需进一步探讨。

图5 血凝素基因序列进化树●：本研究分离株

本研究从免疫发病群分离到一株副鸡禽杆菌，首次发现了核苷酸序列长度为1 008 bp的副鸡禽杆菌，命名为PGSY株。发病鸡场所用二价灭活疫苗是用A型参考株221和C型参考株Modesto制成的，PGSY株的血凝素基因序列比221株和Modesto株分别缺失了27个碱基和18个碱基。分离株比B型参考株0222和我国最早分离的Hp8株(A型)也缺失了27个碱基。PGSY株与同源性最高的SD-1株血凝素基因序列的惟一区别是比其缺失了30个碱基(SD-1株为1 038个碱基[7])。可见分离株序列出现了新特点，可能是导致免疫失败的一个重要原因。

血凝素基因核苷酸序列同源性比较结果表明，PGSY株与国内分离株SD-1具有最高的核苷酸同源性为99%。与疫苗株进行比较分析，显示PGSY株与221株(A型)的同源性为95.7%，与Modesto株(C型)的同源性为94.4%，同源性相对较低。遗传进化分析也表明，PGSY分离株与国内分离株SD-1处于同一进化分支，与221株和Modesto株进化关系较远。总之，从分子水平上看，近年来副鸡禽杆菌的流行菌株确实发生了一些新变化。养禽生产中应该密切监测副鸡禽杆菌的发展变化和重视鸡传染性鼻炎的防控，今后研制与流行菌株匹配性更好的疫苗是合理控制该病的重要措施。

[1] 冯文达．北京鸡传染性鼻炎病原菌的分离鉴定[J]．微生物学通报，1987，5(8)：216-219．

[2] 苗得园，孙惠玲，陈晓峰，等．副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及我国鸡传染性鼻炎的流行状况分析[J]．中国预防兽医学报，2006，28(4)：392-395．

[3] Blackall P J, Christensen H, Beckenham T,etal．Reclassification of Pasteurella gallinarum, [Haemophilus] paragallinarum, Pasteurella avium and Pasteurella volantium as Avibacterium gallinarum gen．nov．,comb．nov．,Avibacterium paragallinarum comb nov．,Avibacterium avium comb．nov．and Avibacterium volantium comb．Nov [J]．International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55：353-362．

[4] 周振成． 副鸡禽杆菌发酵培养工艺的优化及应用[D]．北京：中国农业大学，2014．

[5] 龚玉梅，张培君，孙惠玲，等．三型副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力试验[J]．动物医学进展，2011，32(2)：33-36．

[6] 李杰峰，谢春伏，刘虹，等．副鸡嗜血杆菌分离株致病性和生长特性试验[J]．动物医学进展，2009，30(4)：54-57．

[7] 卢冷轶．我国副鸡嗜血杆菌新血清型的分子病原学和免疫原性的比较研究[D]．北京：中国农业大学，2005．

[8] 张圆圆．23株国内鸡源基因VII型NDV基因组测序分析[D]．北京：中国农业大学，2013．

Diagnosis and Analysis of A case of Infectious Coryza

ZHAO Shi-ying1,2， MA Zhi-jun3, FENG Jin-ling4， XU Yang4， XU Mei-yu4， QIN Yu-cheng5，WU De-guo2， ZHANG Guo-zhong1,4

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China； 2.Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China； 3.Beijing center for animal disease control and prevention, Beijing 102629, China; 4.Diagnostis Center of Livestock and Poultry Epidenic Dieases, China Agricultural University, Beijing 100193, China； 5.Beijing Animal Health Supervision, Pinggu District, Beijing 101200, China)

In this study, a suspected case of infectious coryza were diagnosed and analyzed that occurred on a chicken farm in Beijing. The results of PCR detection and sequencing analysis showed that the chicken group had the infection of Avibacterium paragallinarum. The isolated strains were identified as Avibacterium paragallinarum by staining microscopic examination, biochemical identification and animal infection experimen. The strain was named as PGSY strain. By cloning the hemagglutinin gene of the isolates, the nucleotide sequence was determined and make sequence Alignment compared with the published strains. The results showed that Avibacterium paragallinarum PGSY strain’s hemagglutinin gene length is 1008bp, the nucleotide homology between the SD-1 strain was as high as 99%. However, compare with SD-1 strain, the sequence of hemagglutinin gene of PGSY strain missing 30 bp. Phylogenetic tree analysis showed that this strain and the strains of domestic isolates SD-1 belong to the same evolutionary branch.

Avibacterium paragallinarum ； Isolation and identification ； Sequence analysis

ZHANG Guo-zhong

2016-07-19

家禽产业技术体系北京市创新团队项目(BAIC04-2017)

赵世颖(1988-)，女，工程师，硕士，从事实验动物饲养管理工作，E-mail：syzhao@genetics.ac.cn

张国中，E-mail：zhanggz@cau.edu.cn

S858.31

A

0529-6005(2017)05-0023-04