邓欣鑫 张瑶瑶 虞丽娜 朱霞琳 薛晓婷 赵 莹

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

HPLC法测定通脉止渴胶囊中葛根素含量*

邓欣鑫 张瑶瑶 虞丽娜 朱霞琳 薛晓婷 赵 莹*

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

目的 建立HPLC法测定通脉止渴胶囊中葛根素的含量。方法 采用Synergi4u Hydro-RP80A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇—0.1%磷酸溶液(25∶75)为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长250 nm，柱温25 ℃。结果 HPLC法测定：葛根素溶液在0.0369～0.5529 μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系(r=1)；葛根素平均回收率(n=6)，分别为100.06%、100.04%、99.1%、99.4%、99.4%、100.08%，RSD为0.89%。结论 通过HPLC对葛根素含量测定的结果表明，所检样品符合规定。应用上述色谱法方便且准确，适用于通脉止渴胶囊中葛根素的含量测定与质量评价。

葛根素；HPLC法；通脉止渴胶囊

通脉止渴胶囊为处方药，处方中有十四味药材，葛根素为方中君药，制剂中含量较高。经文献及药典检索，葛根具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等作用[1]。中医临床可用于治疗外感发热头痛，项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热疾，泄泻，眩晕头痛，中风偏瘫，胸壁心痛，酒毒伤中[2]。葛根具有有效的HPLC指标控制成分及方法且常作为中成药物的质控标准，采用HPLC法测定葛根素含量，以利产品质量控制和临床用药的安全有效。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪(型号：岛津LC-20AT SPD-20AT，生产厂家：日本岛津)；电子分析天平(型号：XS205DU，梅特勒-托利多(上海)；紫外可见分光光度计(型号：岛津UV-2700，生产厂家：日本岛津)；数控超声波清洗器(型号：KQ-300DE型，生产厂家：昆山市超声仪器有限公司)；台式电热干燥箱(型号：202-00AB型，生产厂家：天津市泰斯特仪器有限公司)；纯水仪(生产厂家：MILLIPORE)。

1.2 试剂 葛根素(批号：110752-201313，含量：95.5%，中国药品生物制品检定院)；水：超纯水(自制)；甲醇：色谱纯 (默克)分析纯(国药集团)；磷酸(国药集团)；通脉止渴胶囊(某市中医医院)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备[3]

2.1.1 供试品溶液 取胶囊内容物，研细后，精密称取1 g置具塞锥形瓶中，加入50 ml的70%甲醇溶液，密塞并称其重量，超声0.5 h后放置至室温，加70%甲醇适量补至原来重量，摇匀后过滤，精密量取3ml续滤液，置10ml容量瓶中，再加70%甲醇稀释至刻度，即得。

2.1.2 对照品溶液 精密称取葛根素对照品适量，加入甲醇制成36.86 μg/ml的溶液，既得。

2.2 色谱条件[4-5]色谱柱：Synergi4u Hydro-RP80A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75；流速：1.0 ml/min；检测波长：250 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μl。

按照上述方法，对样品及葛根素对照品进行测定，样品中葛根素峰分离度较好，色谱见图1。

图1 通脉止渴胶囊色谱(a为样品，b为对照品)

2.3 方法学考察

2.3.1 流动相的筛选 由于本品是由葛根、当归、川穹、地龙、蜈蚣、黄芪等十四味中药构成的复方制剂，流动相考察实验以方中葛根的质控成分葛根素为对象进行优化。参照药典[6]及相关文献[7-8]以葛根素分离度、保留时间、对称因子、理论塔板数等进行筛选。其中序号1为甲醇∶水=25∶75；序号2为甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75。结果见表1。

表1 流动相考察实验结果

实验结果显示：序号1出峰时间较长，检测时间相对较久，且峰拖尾较严重，序号2的出峰时间快，分离度较好，主峰无拖尾现象，可以满足检测要求，因此选择甲醇∶0.1%磷酸溶液=25∶75为流动相，并在此基础上进行研究。

2.3.2 专属性试验 分别精密吸取葛根对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪进行测定。结果供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间的相同位置上，有相应色谱峰，而阴性对照色谱中无相应色谱峰。说明处方中其他药味对其含量测定并无干扰。

2.3.3 耐用性试验 按照上述所定流动相为基础，将测定条件进行少许变动，再对样品进行测定，计算含量。对主要变动的色谱条件包括检测波长及不同色谱柱进行了考察，以含量为依据，考察耐用性。结果见表2-3。

表2 耐用性-不同波长考察

表3 耐用性-不同色谱柱考察

结果表明：采用测定条件微小波动后的参数对样品进行测定，结果在不同检测波长下和色谱柱条件下测定结果RSD分别为：0.0955，0.0186。表明本方法耐用性良好。

2.3.4 线性范围考察 精密量取对照品储备溶液0.5 ml、1 ml、2.5 ml、5 ml、7.5 ml，均用甲醇稀释至50 ml。分别量取10 μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积(A)对进样质量(M，μg)进行线性回归，回归方程为：y=3918x+9956.5,相关系数R=0.99538，结果表明葛根素溶液在0.0369～0.5529 μg之间呈良好的线性。结果见图2。

图2 葛根素标准曲线

2.3.5 仪器精密度试验 精密量取4项下对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，计算仪器精密度，RSD=0.0015。试验结果显示仪器精密度良好。

2.3.6 样品稳定性试验 取供试品溶液，分别于3、4、5、6、7、8小时，精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，RSD=0.1755，表明供试品溶液在8 h之内稳定性良好，能够满足测定需要，表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.3.7 方法重复性试验 取同一批样品(批号：150415)，平行取6份。按照上述拟定的葛根素含量测定方法，制备供试品溶液。精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算葛根素的含量。结果表明，此方法测定本品中葛根素的含量，RSD=0.8289%<2%，含量测定方法的重复性良好。结果见表4。

表4 重复性实验考察

2.3.8 加样回收率试验 取本品内容物适量，研细，平行取6份样品，约0.5 g，精密称定后，置锥形瓶中，精密加入葛根素对照品储备液5 ml、70%甲醇45 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)0.5 h，放至室温，加70%甲醇补至原来重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3 ml于10 ml容量瓶中，加入70%甲醇溶液定容至刻度，即得供试品溶液。取葛根素对照品适量，精密称定18.43 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得葛根素对照品储备液。取4项下对照品溶液即得(36.86 μl/ml)。精密量取上述溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪进行测定。结果见表5。

表5 回收率实验考察结果

表5结果显示：RSD=0.89%，表明此方法测定本品中葛根素的含量，加样回收率良好。

2.3.9 样品测定 方法学考察结果提示：该测定方法可以作为本品的含量测定方法，准确可行，且操作简便。连续6批本品按供试品溶液方法制备样品溶液，分别精密量取样品溶液10 μl，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，计算葛根素的含量。结果见表6。

表6 样品含量测定结果

结果表明：药材的质量、生产条件等因素一致的条件下，样品的质量稳定。

3 结 论

在本实验各项条件下，对照品及样品中组分均能达到基线分离，其分离度大于1.5，并且峰型良好。用70%的甲醇溶液做为提取溶剂，以甲醇—0.1%磷酸溶液为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长250 nm，柱温25 ℃。建立的HPLC法测定通脉止渴胶囊中葛根素含量的方法，经方法学考察，达到药物检测要求。所以应用上述方法，具有简便，更为准确高效的特点，适用于中药处方通脉止渴胶囊中葛根素的含量测定与质量评价。

[1] 潘丽丽,江帆.高效液相色谱法测定保健食品葛枳胶囊中葛根素的含量[J].贵州师范大学学报,2012,30(2):71.

[2] 赵永良,王 超,韩亚朋.中药现代化研究关键问题与前景[J].中医中药,2011,9(4):124.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2005版.一部[S].北京:中国医药科技出版社,2005:233-234.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010版.一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:272.

[5] 严军,胡静,陈启蒙.高效液相色谱法测定注射用葛根素中葛根素含量[J].天津药学,2008,20(4):27-28.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010版.二部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:1185-1186.

[7] 李静,钱江.HPLC法同时测定复方黄连素片中芍药苷和盐酸小檗碱含量[J].中国药业,2016,25(7):61-62.

[8] 汪秋兰,王文清,马永贵.HPLC法在中药有效成分含量测定中的应用[J].医学导报,2011,30(11):1475.

HPLC method for content determination of puerarin from Pueraria lobata (wild) ohwi. of Tongmaizhike capsule

DENG Xin-xin ZHANG Yao-yao YU Li-na ZHU Xia-lin XUE Xiao-ting ZHAO Ying*

(Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Objective：To establish a HPLC method for content determination of puerarin from Pueraria lobata (wild) ohwi. of Tongmaizhike capsule. Methods：HPLC method was adopted to measure the contents of puerarin in Tongmaizhike capsule. A gilent Synergi4u Hydro-RP80AC18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm) was used. The mobile phase was methanol-1% phosphate (25∶75) with a flow rate of 1.0 ml/min, the UV detection wavelength was 250 nm and the column temperature was 25 ℃. Results: HPLC method for determination: The linear ranges of puerarin solution were 0.0369～0.5529μg/ml, the average recoveries (n=6) of puerarin were 100.06%,100.04%, 99.1%, 99.4%, 99.4% and 100.08%. RSD was 0.89%. Conclusion: The results show that the testing samples in accordance with the regulations and the applications of the chromatographic method are convenient and accurate, and suitable for the contents determination and quality evaluation of puerarin in Tongmaizhike capsule.

Puerarin; HPLC; Tongmaizhike capsule

泰山医学院大学生创新创业训练计划项目(201510439084)。

邓欣鑫(1993—)，女，山东潍坊人，泰山医学院在读本科。

赵莹，女，讲师，主要从事药物化学教学和研究工作。

R927

A

1004-7115(2017)05-0537-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.05.021

2016-12-17)