李咏富+哈益明+郭琴+李庆鹏

摘 要 以γ射线引发顺丁烯二酸β环糊精酯（CDM）和N乙烯基吡咯烷酮（NVP）发生自由基链式反应，制备了顺丁烯二酸β环糊精酯N乙烯基吡咯烷酮聚合物（CDMNVP）。优化后的CDMNVP聚合物的合成条件为： CDM∶NVP为1∶0.7（w/w， CDM 3.6 g 和 NVP 2.52 g），辐照剂量4 kGy，DMF溶液用量为20 mL。在此条件下制备聚合物的产率为84%，重均分子量为20 kDa。结果表明，此聚合物可以同纳他霉素（NM）和多菌灵（MBC）形成稳定复合物。研究了复合物抑菌活性，测定了其表观稳定常数。利用紫外光谱、核磁图谱和相溶解度对药物复合物进行结构表征。303 K下，NMCDMNVP和 MBCCDMNVP复合物的表观稳定系数分别为12988.54和865.94 L/mol。抑菌实验结果表明，NMCDMNVP和 MBCCDMNVP复合物可以显著提高NM和MBC的溶解性和抑菌活性。

关键词 β环糊精； N乙烯基吡咯烷酮； γ射线辐照聚合； 抑菌活性

1 引 言

N乙烯基吡咯烷酮（NVP）常用于合成聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）线性聚合物。PVP是非离子型、水溶性高的高分子精细化学品，具有优异的性能和广泛的用途，PVP是目前国际上公认的合成药中最重要的3种药用辅料之一[1]。对于疏水性药物用PVP作黏合剂，不但易于均匀湿润，而且可使疏水性药物颗粒表面變为亲水性，有利于药物的溶出和片剂的崩解，可加快溶出速率[2，3]。交联的PVP（水不溶）还多用于蛋白的提取及检测中。张伟等[4]利用交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）处理红葡萄酒有效提取蛋白，并直接快速酶解，利用质谱法检测了红酒中的蛋白过敏源。

环糊精的特殊结构使其可与多种分子形成稳定的主客体包合物，已广泛用于分子识别、分子组装、药物载体、模拟酶以及结构异构和立体异构化合物的分离[5]。常用的β环糊精的溶解度低，25℃时在水中的溶解度仅为1.85 g/100 mL [6]。研究者采用了多种方法提高β环糊精在水中的溶解度，其中制备β环糊精高分子聚合物是较为常用的方法之一。制备β环糊精高分子聚合物常用的方法包括化学交联法[7～9]和自由基链式聚合法[10]。自由基链式聚合法包括化学引发和辐射聚合法，与化学交联法相比，无需添加有毒化学交联剂，纯化工艺简单，其中辐射聚合法具有无化学引发剂添加、易于调节、电离辐射与物质作用无选择性等优点[11，12]。

本研究以顺丁烯二酸β环糊精酯（CDM）和N乙烯基吡咯烷酮（NVP）为聚合单体，利用γ射线引发自由基链式反应合成新型水溶性β环糊精高分子聚合物。考察了疏水性抑菌药物多菌灵（MBC）和纳他霉素（NM）在CDMNVP聚合物中的溶解性质及其药物复合物的抑菌效果和药物缓释特性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UV1800紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）； Tensor 37红外光谱仪（德国Bruker Optics公司）； Pyris115热重分析仪（美国Perkin Elmer公司）； AVANCE III核磁共振仪（瑞士Bruker公司）； Quanta 200FEG扫描电子显微镜（美国 FEI公司）； MCR301流变仪（奥地利Anton Paar公司）； Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies公司）

β环糊精购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，使用前，将250 g β环糊精溶于1 L热水（80℃）中，冷却至室温后， 在4℃下重结晶； 弃去上层液体，晶体于90℃干燥； 重复溶解、结晶、干燥2次； 置于干燥器内，备用。

顺丁烯二酸购于阿拉丁试剂（上海）有限公司； N乙烯基吡咯烷酮（NVP）、一水次亚磷酸钠（SHP）、4甲氧基酚和乙醇、NaNO3、NaN3、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·4H2O、蔗糖、琼脂和乙醇均购于国药集团公司化学试剂有限公司。多菌灵（MBC）和纳他霉素（NM）购于上海士锋生物科技有限公司。葡聚糖（Dextran）标准品购于SigmaAldrich 公司，相对分子质量40 kDa。试剂除特别说明外，均为分析纯。黑曲霉菌株04523购于中国科学院微生物研究所。实验用水为二次蒸馏水。

2.2 顺丁烯二酸β环糊精酯的制备

顺丁烯二酸β环糊精酯（CDM）采用半干反应法[13]制备。将6.81 g（6 mmol）βCD同顺丁烯二酸（24 mmol）和次亚磷酸钠（SHP，0.5 倍（mol/mol）顺丁烯二酸用量）加入耐压瓶内，加入阻聚剂4甲氧基酚（2.5%（w/w）顺丁烯二酸用量），混匀后，按固液比1∶0.6 （w/w）加入相应量的水，混匀，110℃反应3.5 h。

2.3 CDMNVP聚合物的合成

称量适量NVP和CDM 于50 mL具塞三角瓶内，混匀。加入DMF溶液（50%，V/V，氮气脱氧）于上述三角瓶内，磁力搅拌至固体溶解，封口膜密封； 60Coγ辐射源进行辐射共聚处理，剂量范围2～10 kGy，剂量率为0.5 kGy/h。反应混合物转移至培养皿，5 mL水洗涤三角瓶3次； 反应物冷冻干燥。干燥后的反应物加入80 mL无水乙醇浸泡24 h，抽滤，滤饼用50 mL无水乙醇在杯式榨汁机中洗涤3次，抽滤，收集滤饼，60°C鼓风干燥箱内干燥6 h，称重。单因素实验以产物产率和CDMNVP的重均分子量作为评价依据。

2.4 CDMNVP聚合物的结构表征

对1 mg/mL CDMNVP聚合物、2 μg/mL丙烯酰胺、5 μg/mL顺丁烯二酸β环糊精酯（CDM）溶液进行紫外光谱测定。少量实验样品与干燥KBr（约300 mg）置于研钵内混匀、研磨、压片，测定其红外光谱。

CDMNVP聚合物样品溶于重水（D2O）中，测定其磁共振图谱，测定温度25℃。

CDMNVP聚合物水溶液的流变学特性采用流变仪测定，温度（25.00 ± 0.01）℃。观察不同浓度下，CDMNVP聚合物和均聚物水溶液的剪切速率与剪切应力之间的关系及溶液表观粘度变化； 考察乙醇浓度对CDMNVP聚合物及均聚物流变学特性的影响和溶液表观粘度的变化。

2.5 相溶解度实验

MBC用1 mol/L HCl溶解，配制成不同浓度的标准溶液，测定281 nm处吸光度值，得到测定多菌灵浓度的标准曲线方程； NM用甲醇溶解，配制成不同浓度的标准溶液，测定303 nm处吸光度值，得到NM的标准曲线方程。用于MBC和NM的浓度测定。

分别将纳他霉素（NM， 50 mg）和多菌灵（MBC， 10 mg）加入含有10 mL 不同浓度CDMNVP聚合物（重均分子量为20 kDa）水溶液（0.5， 1.0， 1.5， 2.0 和 2.5 mmol/L）的具塞三角瓶内，封口膜密封，在303、313和323 K水浴中振荡3 d； 将悬浊液用0.45 μm微孔滤膜过滤，测定滤液中NM和MBC的浓度。不同温度下药物复合物的表观稳定系数（Kc）按式（2）计算[12]：

2.6 抑菌实验

采用察氏琼脂法[13]考察不同浓度下药物复合物对黑曲霉04523的抑制活性。分别吸取相溶解度实验中303 K下的药物滤液（15 μL），分两次加到滤纸片（Ф=

6 mm）上，将滤纸片均匀分布于琼脂培养基上，35℃恒温培养箱内培养30 和48 h后，测量抑菌圈大小。

2.7 CDMNVP聚合物中单体残留量测定

配制含NPV分别为0.05、0.25、0.50、1.00、5.00和10.00 μg/mL的系列溶液，色谱法测定，绘制标准曲线。色谱条件如下： 色谱柱为InnovalC18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流动相为乙腈水（15∶85， V/V）； 流速 1.0 mL/min； 紫外检测波长200 nm； 进样量 10 μL； 柱温 25℃。

CDMNVP聚合物用10%（V/V）乙腈水溶解，溶液浓度为1 mg/mL，色谱条件同上。NVP残留量以外标法进行定量分析。

3 结果与讨论

3.1 影响CDMNVP制备的因素

PVP结构中存在大量的内酰胺鍵，在280 nm处有很强的紫外吸收（图1C），而碳水化合物在此波长下紫外吸收很弱（图1A）。在CDMNVP聚合物中同时含有β环糊精基团和NVP结构中的内酰胺键，因此在CDMNVP聚合物凝胶色谱图（图1B）中具有弱紫外吸收的峰1为CDMNVP聚合物，具有强紫外吸收的峰2为PVP均聚物； 在溶剂峰（22 min）后为未反应的NVP单体及其它盐类分子的示差吸收峰。辐照法合成CDMNVP聚合物的副反应为NVP单体分子间的自聚反应。

随着NVP反应物量的增加，聚合物和均聚物的分子量随之增大，有利于聚合物分子链的延长。但NVP的量加大，会造成产率的降低，因为增加单体浓度的同时也增加了均聚反应。辐照剂量的增加会造成产物产率的下降，增大辐照剂量也会增加副反应的发生； 此外，CDM单体有可能因过高的辐照剂量而发生降解。随着DMF溶液用量增加，聚合物和均聚物的分子量随之增高，产物的产率随之降低，因为溶液体积增加，降低了CDM与自由基作用的几率，有利于NVP单体参与均聚反应。

优化后的CDMNVP聚合物的合成条件： CDM与NVP质量比为1∶0.7（3.6 g CDM 和 2.52 g NVP），辐照剂量4 kGy，50%（V/V）DMF溶液20 mL。聚合物的产率为84%，聚合物分子量为20 kDa。

切速率之间呈现明显的线性关系（图4E），PVP均聚物水溶液是典型的牛顿型流体。CDMNVP聚合物与PVP均聚物之间的流变学差异也证明合成得到了CDMNVP聚合物。CDMNVP聚合物流体类型与PVP均聚物的流体类型不同，可能是NVP结构中五元环结构与CDMNVP聚合物中β环糊精的环状之间的作用力所致。CDMNVP聚合物水溶液的表观粘度与浓度之间呈线性关系（图4C）。在乙醇溶液中，CDMNVP聚合物呈现出牛顿型流体的特性（图4B），其剪切应力与剪切速率之间存在明显的线性关系，这可能与CDMNVP聚合物中PVP链段容易溶于乙醇有关，加入乙醇后，降低了NVP中五元环结构同β环糊精的环之间的作用力。随着乙醇浓度的增加，CDMNVP聚合物表观粘度先增大后减小（图4D），而PVP均聚物的表观粘度随乙醇浓度的增加呈线性增长。乙醇对CDMNVP聚合物的水化层造成了破坏，增大了CDMNVP聚合物分子间的作用力，从而使得开始阶段聚合物水溶液的表观粘度随乙醇浓度的增大而增大； 而随着乙醇浓度进一步增大，CDMNVP聚合物中PVP链段开始溶于高浓度乙醇，使得分子间的阻力变小，CDMNVP乙醇溶液的粘度开始下降。

3.3 相溶解度

药物在CDMNVP聚合物水溶液中的溶解度与聚合物的摩尔浓度呈现良好的线性关系（图5）。303 K下，随着聚合物浓度增加， NM和MBC的溶解度分别增加了17.4倍和2.78倍。与MBC相比， CDMNVP聚合物仅对NM有很好的增溶作用。NM和MBC在CDMNVP聚合物水溶液中的表观稳定系数见表2。

303 K下， NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP复合物的表观稳定系数明显高于NM在βCD中的表观稳定系数（1010 L/mol）和MBC在HPβCD中的表观稳定系数（61.07 L/mol）。NM·CDMAM复合物在水溶液中的稳定性更高，因为NM分子结构更大，更加适合聚合物中βCD环的大小。随着温度的升高， NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP复合物的表观稳定系数Kc逐渐下降，说明药物与聚合物形成包埋复合物的过程有可能是放热过程，升高温度不利于复合物的稳定。CDMNVP对NM的溶解性优于顺丁烯二酸β环糊精酯丙烯酰胺聚合物（CDMAM）[14]。NM和CDMNVP中PVP链段在亲水性上具有相似性，NM和CDMNVP在乙醇水中的溶解性较好，根据相似相溶原理，NM更易溶解于CDMNVP的水溶液。

3.4 CDMNVP药物复合物的结构表征

对比MBC、NM与其同CDMNVP的药物复合物的紫外图谱，MBC最大紫外吸收波长在274.6 nm处，NM的最大紫外吸收波长在303.5 nm处[14]，而药物复合物的最大吸收波长分别红移至275.3 nm和305 nm（图6A）说明MBC 和NM与CDMNVP聚合物形成了包埋复合物。

如图6B所示， MBC中苯环上H的化学位移在7.13 ppm（2H和3H）和7.40 ppm（1H 和4H）。NM结构中不饱和酯键中上乙烯基氢（1H 和2H）的化学位移为6.41 ppm，共轭多烯结构上氢（15H ～ 22H）的化学位移为6.08 ppm [14]。当MBC与CDMNVP聚合物形成复合物后，MBC中苯环上H的化学位移向低场移动，苯环上H的化学位移在7.44 ppm（2H和3H）和7.64 ppm（1H and 4H）处。而在NM·CDMNVP复合物中，NM结构中不饱和酯键中上乙烯基氢（1H和2H）的化学位移移向低场6.76和6.73 ppm处。上述结果表明，MBC和NM分别同CDMNVP形成了包埋复合物。

3.5 CDMNVP药物复合物的抑菌效果

NM和MBC与CDMNVP聚合物形成复合物后，提高了NM和MBC的抑菌活性，并延长了其抑菌时间。随着CDMNVP聚合物浓度的增大，其对药物NM和MBC的吸附量也增大，因而其药物复合物的抑菌活性增强（图7），抑菌时间延长。由于NM在CDMNVP水溶液中具有更好的溶解性，NM·CDMNVP复合物的抑菌效果明显好于MBC·CDMNVP复合物的抑菌效果。

3.6 CDMNVP中N乙烯基吡咯烷酮残留量

辐照剂量为2、4、6、8和10 kGy时，CDMNVP聚合物中NVP残留量分为0.13、0.072、0.047、0.023和0.012 μg/mg。随着辐照剂量的增大，NVP的残留量逐渐降低。比较CDMNVP及顺丁烯二酸β环糊精酯丙烯酰胺（CDMAM）聚合物中单体残留量[14]，CDMNVP聚合物中单体残留远低于CDMAM聚合物中单体的残留量，说明NVP单体更容易发生辐照聚合。

4 结 论

NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP的表观稳定系数低于NM·CDMAM和MBC·CDMAM復合物的稳定系数[14]，尤其是MBC·CDMAM稳定系数下降更为明显，主要是由于CDMNVP聚合物分子量下降所致，CDMNVP的重均分子量为20 kDa。但NM在CDMNVP溶液中的浓度高于其在CDMAM聚合物溶液中的浓度，说明单体种类对药物溶解性也有很大影响。CDMNVP聚合物中PVP链段与NM在溶解性上具有相似性，NM更容易同聚合物分子上βCD结构单元发生包埋复合作用。对于不种单体制备的βCD高分子聚合物，聚合单体的性能和结构对于药物复合物的稳定作用有很大的异。这种影响主要取决于βCD高分子聚合物中两个CDM单元之间均聚物链段（PVP和PAM）同药物分子之间溶解性差异和βCD高分子聚合物分子量的大小。

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Abstract βCyclodextrinNvinyl2pyrrolidone （CDMNVP） copolymer was prepared by free radical chain reaction of Nvinyl2pyrrolidone （NVP） and βCD maleate （CDM） with γray as initiator. The synthesis conditions of CDMNVP polymer were as follows： mass ratio of CDM to NVP was 1∶0.7 （CDM 3.6 g and NVP 2.52 g）， irradiation dosage was 4 kGy， and DMF aqueous solution （50%， V/V） was set at 20 mL. Under the synthesis conditions， the yield of CDMNVP was 84% and the weightaverage molecular weight was 20 kD. The natamycin （NM） and carbendazim （MBC） could form stable inclusion complexes with CDMNVP copolymer， and the solubility and fungicidal activity of the complexes were investigated. The stability constant of NM·CDMNVP and MBC·CDMNVP complexes at 303 K were 12， 988.54 L/mol and 865.94 L/mol， respectively. The complexes were characterized using phase solubility diagrams， nuclear magnetic resonance （NMR） spectra and ultraviolet （UV） spectra. The analysis of the biological activities of these two complexes indicated that they possessed enhancing fungicidal activities compared to NM and MBC alone.

Keywords βCyclodextrin； NVinyl2pyrrolidone； γRay initiated polymerization； Bacteriostatic activity