余 程，刘 妍，王胜军，汪文俊

（武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，中南民族大学生命科学学院，湖北武汉430074）

黄曲霉毒素B1致肉仔鸡肝损伤的氧化应激机制研究

余 程，刘 妍，王胜军，汪文俊*

（武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，中南民族大学生命科学学院，湖北武汉430074）

本试验旨在研究黄曲霉毒素B1（AFB1）对肉鸡原代肝脏细胞线粒体氧化磷酸化、线粒体膜电位、活性氧（ROS）、细胞凋亡、抗氧化酶及其相关基因表达的影响。选取18～20日龄健康爱拔益加（AA）肉鸡分离的肉鸡原代肝脏细胞（BPHs），分为3个处理组，每个处理组5个重复，试验组分别添加1 μmol/L和2 μmol/L的AFB1，对照组添加等量的DMSO。结果表明：随着AFB1浓度的升高，线粒体Ⅲ和Ⅳ呼吸作用显著增强（P＜0.05），而线粒体呼吸控制率却显著下降（P＜0.05）；随着AFB1浓度的升高，线粒体电位下降，并呈现浓度依赖型模式，当AFB1为2.5 μmol/L时BPHs线粒体电位显著下降（P＜0.05）；AFB1极显著引发了ROS的产生（P＜0.01）；高浓度的AFB1（2.5 μmol/L）处理使得BPHs细胞凋亡率明显上升（P＜0.05）以及caspase-3、caspase-9表达明显增加（P＜0.05）；AFB1显著提高了Nrf2的mRNA表达水平（P＜0.05）；与对照组相比，HO-1、SOD的mRNA表达量显著下降（P＜0.05）；高浓度的AFB1（2.5 μmol/L）显著提高了NQO1的mRNA表达水平（P＜0.05）。以上研究结果显示，AFB1使线粒体氧化磷酸化过程解偶联，线粒体膜电位下降，ROS大量产生，抗氧化酶活力降低，细胞发生凋亡，抗氧化酶相关基因mRNA表达下降，而Nrf2基因mRNA表达增强。AFB1导致胞内ROS上升引发氧化应激，可能与Nrf2信号通路有关。

黄曲霉毒素B1；线粒体功能；活性氧；凋亡；抗氧化酶基因；肉鸡

饲料、食品及其原料广泛受到霉菌毒素污染是一个全球性问题。世界粮农组织发现作物受黄曲霉毒素的污染，尤其是黄曲霉毒素B1（AFB1），每年造成大量的畜牧业损失[1-2]。AFB1对肝脏有特殊的亲和性，经肝脏代谢为毒性极强的AFB1-8,9-环氧化物（AFBO）等，进入机体后产生活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）而引发氧化应激反应，造成毒性反应，导致畸形、突变甚至癌症的发生[3-5]。肝细胞线粒体中氧化磷酸化电子传递链是重要的能量代谢过程，也是胞内ROS产生的主要场合，药物诱导肝损伤（Drug Induced Liver Injury，DILI）时线粒体氧化磷酸化会发生解偶联[6-7]，ROS大量产生而引发氧化应激。很多研究表明，AFB1诱导肝细胞产生ROS，进而引发氧化应激而导致肝损伤及一系列毒害反应，可能与Keap1-Nrf2-ARE（Kelch-like ECH-associated protein-1, Keap1；NF-E2-ralated factor 2, Nrf2; antioxidant-responsive element, ARE）、NF-κB （Nuclear Factor Kappa-lightchain-enhancer of Activated B cells）等信号通路激活等有关[3,8-10]。前期研究表明，AFB1导致肉鸡肝脏炎症、出血甚至细胞坏死，肝损伤严重[11]，然而AFB1致肉鸡肝损伤中的氧化应激机制并不清楚。本试验采用爱拔益加（AA）肉鸡分离的肉鸡原代肝脏细胞（Broiler Primary Hepatocytes，BPHs）为研究对象，进行AFB1对肉鸡肝损伤的氧化应激机制研究，阐明AFB1诱导肝损伤的机制，找到阻止或缓解AFB1的方法，减少与肝脏相关的疾病发生。

1 材料与方法

1.1 材料 AFB1、HEPES、胶原酶、牛血清蛋白、JC-1购自Sigma，总SOD、ROS、BCA 蛋白质测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，caspase-3、caspase-9、β-actin抗体购自Santa Cruz公司，William's E培养基购自Caisson公司,Percoll细胞分离液购自南京森贝伽生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 肉鸡原代肝脏细胞分离 先取18～20日龄健康的AA肉鸡，在腹部注射麻醉剂，然后固定，用乙醇对胸腹部全面消毒，并剪开露出肝脏，泵入缓冲液 A（10 mmol/L HEPES，137 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，3 mmol/L Na2HP04，pH 7.5），随后剪断另一脉管，缓冲液A约剩50 mL时，将缓冲液B(0.6 g/L CaCl2和0.4 g/L IV型胶原酶的缓冲液A)倒入与之混合，继续灌注15 min，将肝脏取出放入无菌平皿剪碎、清洗，捣碎，100目无菌尼龙网过滤，培养液清洗，收集细胞滤液，离心清洗2次，然后用10×缓冲液A和Percoll液按1:1比例配制的混合液，离心，加入培养液重悬细胞，细胞计数后稀释到2×105cells/mL，分装到预先用胶原蛋白处理的培养皿或培养板，于CO2培养箱39℃培养[11]。试验中设置对照试验，其中试验组培养液分别添加1、2.5 μmol/L的AFB1（AFB1以DMSO为溶剂，DMSO终浓度＜0.1%），不同时间取样做相关分析。对照组采用无AFB1的培养液培养，不同时间取样做相关分析。试验分为5个重复，每次重复3个平行试验，下述试验组进行相同重复和平行试验数。

1.2.2 线粒体氧呼吸试 采用配备有Clark型氧电极的Oxytherm 氧呼吸系统（Hansatech公司）测定氧消耗。对各组培养的BPHs匀浆，600 r/min离心5 min，沉淀用线粒体提取缓冲液悬浮，10 000 r/min离心10 min，沉淀悬浮在0.5 mL线粒体提取缓冲液中，制备成线粒体悬液备用，BCA法测定线粒体悬液蛋白质的浓度。将获得的线粒体等分为2份，分别用于同时测定谷氨酸钠/苹果酸钠（5 mmol/L /2.5 mmol/L）和琥珀酸二钠（5 mmol/L） 的呼吸试验。测氧仪反应槽中加入测定缓冲液稳定2 min后，加入新鲜分离的肝脏线粒体悬液20 μL，记录3 min，加入外源底物琥珀酸二钠20 μL，出现Ⅳ态呼吸；记录约2 min后，加入ADP （50 mmol/L）8 μL，出现Ⅲ态呼吸，待ADP完全消耗后线粒体又恢复到IV态呼吸；加入ADP时（Ⅲ态）的呼吸速率与ADP耗竭后（Ⅳ态）的呼吸速率的比值即为线粒体呼吸控制率（Respiratory Control Ratios，RCR），能够反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。

1.2.3 线粒体膜电位分析 JC-1（5,5',6,6'-tetrachlo ro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimi dazolycarbocyanine iodide）是检测线粒体膜电位的荧光探针。在处理好的BPHs悬液中加入1 mL浓度为5 mg/mL的JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中39℃孵育20 min，吸除上清，用JC-1染色缓冲液 （1×） 洗涤2次，Nikon C1SI全光谱激光共聚焦显微镜下观察。检测JC-1单体，激发光为488 nm，发射光为530 nm。检测JC-1聚合物时，激发光为525 nm，发射光为590 nm。

1.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡 取试验组培养的BPHs（细胞浓度为0.2～1×107cells/mL），预冷PBS清洗后离心，100 μL 1×binding缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL propidium iodide（PI）染色液，使荧光染料和细胞充分接触，25℃避光处理20 min，PBS液清洗，600 r/min离心3 min，小心去上清，再加入200 μL 1×binding缓冲液重悬细胞，上BDⅢ流式细胞仪测定，至少检测10 000个细胞。

1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）测定 采用总SOD测定试剂盒进行测定SOD活力。

1.2.6 ROS测定 ROS采用DCFH-DA（2,7-dichl orofluorescein diacetate，二氯荧光素二乙酸酯）法测定。取各试验组BPHs，用100 μL含10 μmol/L DCFH-DA的培养液37℃孵育20 min，PBS清洗3次，采用DCFH-DA试剂盒按照说明测定ROS。

1.2.7 免疫杂交 取各试验组BPHs，加入0.5 mL含蛋白酶抑制剂并预冻的裂解缓冲液4℃分别裂解10～15 min，裂解液4℃、13 000 r/min离心20 min，上清液变性处理即为蛋白样品。在制备好的凝胶上样，电泳结束将凝胶取出用适量TBS液平衡5 min，将凝胶上的蛋白转移到预先用甲醇激活的PVDF上（转膜），用TBS液洗膜，室温下用封闭液封闭1.5 h，将膜分别放入相应的一抗稀释液中（按说明书的比例稀释），4℃脱色摇床孵育过夜，用TBST液洗膜3次，然后加入相应二抗（按说明书的比例稀释），室温脱色摇床孵育1～2 h，TBST液清洗3次，曝光拍片，以β-actin抗体所得结果为对照组并标准化。

1.2.8 定量RT-PCR分析 对试验各组BPHs采用Trizol法提取总RNA。取适量细胞，用1 mL的Trizol匀浆、涡旋后，室温孵育3 min，加入0.2 mL氯仿，涡旋30 s，室温孵育1 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，小心将约400～450 μL上清液转移到新的离心管中，加入等体积预冻的70%乙醇，轻轻颠倒几次混匀。将混匀液加入到RNA分离柱，缓冲液清洗，然后将RNA分离柱和离心管一起于4℃、12 000 r/min离心1 min以除去多余液体。往RNA分离柱（置于1.5 mL收集管）中加入50 μL无RNase水，4℃、13 000 r/min离心5 min，收集管中即得到要分离的总mRNA，取上述mRNA溶液1 μL用NanoDrop 1 000仪器测定mRNA浓度与纯度，确保所有RNA样品的OD260/OD280在1.8～2.0，用于实验室定量RT-PCR分析，基因及其引物见表1。

表1 用于定量RT-PCR的基因及其引物

1.2.9 统计分析 试验数据以平均值±标准差表示，使用SPSS 13.0进行分析，显著性分析采用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 AFB1诱导BPHs线粒体呼吸链的解偶联效应随着AFB1浓度的升高，线粒体Ⅲ和Ⅳ呼吸作用明显增强（P＜0.05），并呈现浓度依赖型模式，而线粒体RCR却显著下降（P＜0.05），当AFB1浓度1 μmol/L时为1.09，2.5 μmol/L时为1.02（图1），这表明AFB1具有很强的线粒体呼吸作用、解偶联作用，使得线粒体氧化磷酸化过程发生了严重的解偶联效应。

2.2 AFB1对BPHs线粒体膜电位的影响 如图2所示，随着AFB1浓度升高，线粒体电位下降，并呈现浓度依赖型模式，当AFB1为2.5 μmol/L时BPHs线粒体电位极显著下降（P＜0.01）。随着AFB1对线粒体呼吸链的解偶联，线粒体膜电位发生去极化效应。随着AFB1浓度的升高，JC-1的红绿荧光值之比显著下降（P＜0.05），证实了线粒体膜电位发生去极化，也进一步表明AFB1是一种作用明显的氧化磷酸化解偶联剂。

2.3 AFB1引发的氧化应激效应 为了研究不同浓度的AFB1诱导的氧化应激，测定了BPHs在AFB1诱导下ROS产生和SOD活力的变化。如图3所示，SOD活力随着AFB1浓度增加而呈浓度依赖型降低（图3A）。AFB1极显著地引发了ROS的产生（P＜0.01），随着AFB1浓度的增加，ROS也呈浓度依赖型增加（图3B)。

图1 AFB1对BPHs线粒体呼吸作用的影响

2.4 AFB1引发BPHs凋亡 相比对照组，低浓度的AFB1（1 μmol/L）处理后，前期凋亡、后期凋亡和细胞坏死率无明显区别；而高浓度的AFB1（2.5 μmol/L）处理后，BPHs细胞凋亡率明显上升，前期凋亡率为24.5%，后期凋亡率也达到12%，可见细胞受损严重（P＜0.05）（图4 A）。2.5 μmol/L的AFB1处理组使得caspase-3、caspase-9表达明显增加，而低浓度的AFB1（1 μmol/L）处理组与对照组相比无明显差异（P＞0.05）（图4 B，4C）。此结果也与流式细胞检测结果互为印证，表明高浓度的AFB1导致细胞凋亡。

2.5 AFB1对BPHs氧化应激基因表达的影响 如图5所示，低浓度的AFB1（1 μmol/L）显著提高了Nrf2的mRNA表达水平（P＜0.05）；高浓度的AFB1（2.5 μmol/L）极显著提高了Nrf2的mRNA表达水平（P＜0.01）。与对照组相比，HO-1、SOD的mRNA表达量显著下降（P＜0.05）。与对照组相比，低浓度的AFB1（1 μmol/L）对NQO1的mRNA表达无明显影响，而高浓度的AFB1（2.5 μmol/L）显著提高了NQO1的mRNA表达水平（P＜0.05）。

图 2 AFB1对BPHs线粒体膜电位的影响

图3 AFB1对BPHs氧化应激的影响

图4 AFB1对肉鸡肝脏原代细胞凋亡的影响

图5 AFB1对肉鸡肝脏原代细胞中二相酶和Nrf2表达的影响

3 讨 论

AFB1对肝脏具有独特的亲和性，大量文献表明AFB1会导致严重的肝损伤[3-5,11-12]，然而AFB1诱导肉鸡肝损伤的机制并不明确。具有肝毒性的药物以多种方式损伤肝脏线粒体[5-6]，AFB1是众所周知的肝毒性化学物质，石达友等[4,12]研究了AFB1对肉鸡肝线粒体自由基代谢及线粒体膜渗透性变化，表明AFB1因线粒体渗透性增强，导致氧自由基增加。为获得阻止或缓解AFB1的新方法，更清楚的阐明AFB1诱导肝损伤机制显得十分重要。

3.1 AFB1诱导BPHs线粒体呼吸链的解偶联效应研究表明，肝细胞线粒体中氧化磷酸化电子传递链是重要的能量代谢过程，药物诱导肝损伤时线粒体氧化磷酸化会发生解偶联[6-7]。RCR是Ⅲ态呼吸率与Ⅳ态呼吸率的比值，可反映线粒体的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。RCR下降表明线粒体氧化磷酸化偶联程度下降，线粒体功能受损。本研究表明，线粒体Ⅲ和Ⅳ呼吸作用明显增强，而RCR显著下降，表明AFB1具有很强的线粒体呼吸作用解偶联作用。

3.2 AFB1对BPHs线粒体膜电位的影响 线粒体能量代谢障碍导致膜电位下降，线粒体膜电位是反映线粒体功能的重要指标[13-14]。JC-1是一种用于检测线粒体膜电位的荧光探针，在线粒体膜电位较高时（细胞处于正常状态），JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光，在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光，用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。本研究表明，随着AFB1浓度的升高，JC-1的红绿荧光值之比显著下降，证实了线粒体膜电位发生去极化，也进一步表明AFB1是一种作用明显的氧化磷酸化解偶联剂。

3.3 AFB1引发的氧化应激效应 AFB1诱导ROS的产生，诱导肝脏细胞损伤[3-5]。前期研究结果表明，肉鸡饲喂含AFB1（0.4 mg/kg）的饲料使得SOD活力降低，而随过氧化物酶（MPO）活力上升，血样的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活力上升，肝脏组织病理学表明肝组织恶化，肉鸡肝损伤严重[11]。本研究表明，AFB1极显著地引发了ROS的产生，而SOD活力显著下降，表明ROS的产生可能抑制抗氧化酶（如SDO）的活力。AFB1对SOD活力的抑制效应也表明AFB1导致了细胞内的氧化应激效应，可能是其细胞毒性的原因之一。

3.4 AFB1引发BPHs凋亡 半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制中起主要作用。目前，已发现该蛋白酶家族共有13个（caspase1-13），其中起凋亡启动子作用的有caspase8、9、10，起凋亡效应子作用的有caspase3、6、7。Caspase-3 被称作“死亡蛋白酶”，是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，可产生一系列反应，使凋亡不可避免[15]。本研究免疫杂交试验表明，AFB1处理后，caspase-3、caspase-9表达明显增加，说明AFB1诱导了肝细胞的凋亡，这一结果与Brahmi等[16]研究结果一致。此结果也与流式细胞检测结果互为印证，表明高浓度的AFB1导致细胞凋亡。

3.5 AFB1对BPHs氧化应激基因表达的影响 氧化应激是导致细胞损伤甚至恶变的重要因素，Nrf2是参与氧化应激的重要转录因子。ROS的存在会激活Nrf2转位到核内后结合到抗氧化反应单元（Antioxidant Response Elements，ARE）结合，而诱导一系列的二相解毒酶基因（如NQO1、HO-1、SOD等）表达。研究表明，AFB1引起肉鸡肝脏细胞内ROS大量产生，引发氧化损伤，导致与氧化应激相关的转录调控因子Nrf2表达增加[3,17]。本研究结果表明，Nrf2的mRNA表达显著增加，而NQO1、HO-1、SOD等基因在高浓度AFB1作用下有所降低。结合前述研究结果，可能是细胞凋亡或坏死引起表达量的下降。

4 结 论

本研究表明，AFB1是线粒体氧化磷酸化解偶联剂，肉鸡原代肝脏细胞胞内ROS增加，SOD活力下降，引发氧化应激，导致Nrf2基因的mRNA表达增强，而与肝脏解毒相关的二相解毒酶基因如NQO1、HO-1、SOD的mRNA表达下降。

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S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-092

2016-11-04；

2017-01-29

湖北省自然科学基金（2016CFB487）；中央高校基本科研业务费专项资金重点项目（CZZ16003）

余程（1991-），女，湖北武汉人，硕士，主要从事天然产物与动物营养研究，E-mail：1463816568@qq.com

* 通讯作者：汪文俊，E-mail：hustwsir@126.com