岳 峰

邯郸市中心医院普外二科，河北 邯郸 056001

分化抑制因子-2及上皮性钙黏附素在结肠癌中表达的研究

岳 峰

邯郸市中心医院普外二科，河北 邯郸 056001

目的研究分化抑制因子-2(inhibitor of differentiation-2,Id-2)和上皮性钙黏附素(epithelical cadherin,E-cadherin) 在结肠癌组织中的表达及其相关性。方法采用HE 染色观察癌旁正常组织、癌组织的病理改变情况；免疫组织化学方法检测Id-2和E-cadherin在癌旁正常组织、癌组织中的表达水平，Spearman相关检验检测Id-2 与E-cadherin 表达的相关性。结果HE 染色结果：结肠癌组织：癌细胞分化差，多形性，大小不一。可呈假复层，核大，胞浆少，容易找到核分裂。免疫组织化学检测结果：Id-2 在癌旁正常黏膜组织和结肠癌组织的阳性表达率分别为57.5%和82.5%; E-cadherin 的阳性表达率分别为72.5% 和 42.5%。两组Id-2和E-cadherin的阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析：Id-2 与E-cadherin 的表达水平呈负相关性(P<0.05)。结论结肠癌组织中Id-2高表达可能通过E-cadherin 促使肿瘤组织细胞发生侵袭、转移。

结肠癌；分化抑制因子-2；上皮性钙黏附素；免疫组织化学

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤。近年来由于饮食结构和生活环境的变化，其发病率有逐年增高的趋势，且逐步趋向年轻化，因此其发生、发展的相关机制引起众多学者的兴趣。

分化抑制因子(inhibitor of differentiation, Id)又称DNA 结合抑制因子(inhibitor of DNA binding)是Perk等[1]于1990年首先从鼠红白血病(murine erythroleukemia, MEL)细胞cDNA文库中克隆,属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix, HLH)转录因子家族成员之一, 哺乳动物含有4种 Id 因子(Id1～Id4)。因 Id 蛋白本身缺乏DNA 结合所必须的碱性结构域， 与 bHLH 结合成异二聚体后， 可抑制 bHLH 与 DNA 及其他组织特异性 bHLH 转录因子结合， 具有抑制细胞分化、 促进细胞增殖、 诱导细胞凋亡、 维持细胞存活、促进血管形成等作用[2]。随着研究的深入，发现其在不同组织的发育与肿瘤进展中表现出生物多样性，如在胚胎发生和器官形成、肿瘤的浸润、肿瘤的分化高低、侵袭转移行为以及不良预后等[3]。其中Id-1在多种肿瘤中的诊断和治疗价值已得到广泛认可，随着研究深入，近年来Id-2与肿瘤的发生、发展受到广大学者的关注。

上皮性钙黏素(epithelical cadherin,E-cadherin)属于钙依赖黏附蛋白家族成员之一，其主要功能是维持上皮细胞的极性以及上皮细胞之间的黏附连接，并且能够有效抑制肿瘤细胞向其他组织的侵袭和转移。许多研究发现许多恶性肿瘤尤其是上皮性来源的恶性肿瘤的侵袭和转移与E-cadherin的表达水平及功能障碍有密切相关性。

有研究表明Id-2在胃癌、食管癌、乳腺癌等多种肿瘤中的表达及临床意义，但尚未发现Id-2和E-cadherin在结肠癌组织中的表达及其相关性。本研究主要采用HE 染色观察癌旁正常组织及癌组织的病理改变；免疫组织化学方法观察Id-2和E-cadherin在癌旁正常组及癌症组中的表达水平。Spearman检验检测Id-2 与E-cadherin 表达的相关性, 为临床上治疗结肠癌提供新的理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源：收集2013年1月1日-2014年9月1日邯郸市中心医院经手术切除的原发性结肠癌组织标本40例，男22 例，女18例。年龄34～74岁，中位年龄62岁。有淋巴结转移者25例，无淋巴结转移者15例。所有标本中均以癌症组织的中心组织为癌症组, 以距癌组织5 cm的正常组织为癌旁正常组。组织学分型采用2000年WHO 标准, 中-高分化25例，低分化15例。纳入标准：(1)断端组织均未发现癌细胞。(2)取材前均未接受化疗及放疗。(3)均无糖尿病及糖耐量等异常病史。

1.1.2 主要试剂及仪器：鼠抗人Id-2和E-cadherin多克隆抗体(北京中杉金桥公司)；SP免疫组化试剂盒(北京中衫金桥公司)；DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；显微照相机(日本Olympus公司)；切片机(德国Leica公司)；电热恒温烤箱(重庆实验设备厂)；ZD-IIIB型医用微波炉(上海中达医学应用研究所)；莱卡病理成像系统(德国LEICA公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 临床病理分期和病理组织学观察：按照国际抗癌联盟(international union against cancer, UICC)和美国肿瘤联合会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)合作制定了第7版肿瘤TNM分期[4-5]，对结肠癌进行分期，Ⅰ期10例，Ⅱ期7例，Ⅲ期12例，Ⅳ期11例。取上述结肠癌组织和癌旁正常组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，4 μm切片，展片，进行苏木素-伊红(HE)染色。由病理科医师在双盲状态下，光镜下观察直肠病理组织学变化。

1.2.2 HE染色：石蜡切片二甲苯浸泡→脱蜡→酒精脱水→哈瑞(Harris)氏苏木精染色→1%盐酸酒精溶液分化20 s→1%氨水返蓝5 min→伊红液染色→酒精脱水→二甲苯透明→中性树胶封片→显微镜下观察结果。

1.2.3 免疫组织化学法(SP法)：SP法检测人结肠癌组织中Id-2和E-cadherin蛋白的表达，石蜡切片→石蜡切片脱蜡至水→H2O2室温孵育去除内源性过氧化物酶活性→PBS冲洗→抗原修复→PBS冲洗→山羊血清封闭→一抗Id-2和E-cadherin冰箱过夜→PBS冲洗→二抗→PBS冲洗→三抗→PBS冲洗→DAB显色→苏木素复染，封片，显微镜下观察Id-2和E-cadherin蛋白表达。

1.3 结果判定标准

1.3.1 E-cadherin 染色结果判定方法：细胞膜呈棕黄色颗粒至深棕黄色颗粒为强阳性细胞，胞浆和(或) 胞核呈淡棕黄色至深棕黄色者为阴性细胞至弱阳性细胞。阳性细胞率< 10% 为阴性(-)，阳性细胞率10%～90%为弱阳性(±)，阳性细胞率>90%为强阳性(+)。阳性率=弱阳性率+强阳性率。

1.3.2 Id-2染色结果判定方法：肿瘤细胞胞质内呈棕黄色细颗粒状着色为Id-2 阳性表达。根据细胞着色强度和阳性细胞数比例采用半定量积分判断结果，着色强度计分: 无色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分，染色强度以背景着色作对比; 阳性细胞比例计分: 无阳性细胞计0分，阳性细胞≤25% 计1分，阳性细胞26%～50%计2分，阳性细胞51%～75% 计3分，阳性细胞≥76%计4分。两者计分相乘：0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～8分为中阳性(++)，9～12分为强阳性(+++) 。阳性率=弱阳性率+中阳性率+强阳性率。

1.4 统计学分析采用SPSS 14.0 软件进行处理，组间比较采用χ2检验，采用Spearman相关分析Id-2 与E-cadherin 表达相关性。P<0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果结肠癌旁正常黏膜组织：黏膜表面光滑，无绒毛。上皮为单层柱状，由柱状细胞和大量的杯状细胞组成。固有层内含有大量单管状的大肠腺，腺管大小一致，排列整齐。主要由柱状细胞和大量的杯状细胞组成。固有层内可见孤立淋巴小结。黏膜肌层由薄层的内环行和外纵行平滑肌构成(见图1A)。结肠癌组织：中-高分化癌组织由大小不一的腺管构成，低分化腺癌，癌组织中仅见少量不规则腺管样结构，可形成不规则的细胞条索和癌巢。癌细胞分化差，多形性，大小不一。可呈假复层，核大，胞浆少，容易找到核分裂(见图1B)。

2.2 免疫组织化学结果

2.2.1 Id-2 在结肠黏膜组织中的表达情况：结肠癌组织标本中可见Id-2 着色呈棕黄或棕褐色，位于细胞质中, 阳性细胞多并呈弥漫状分布;癌旁正常组织中也可见着色, 但是阳性细胞数少，呈浅黄色染色, 散在分布于细胞质中;结肠黏膜组织中阳性表达极少(见图2)。Id-2 的阳性率在癌旁正常结肠黏膜组织、结肠癌组织中分别为57.5%和82.5%，差异有统计学意义,(P<0.05，见表1)。

2.2.2 E-cadherin在结肠黏膜组织中的表达情况：结肠癌旁正常组织中可见E-cadherin 着色呈棕黄或棕褐色，位于细胞膜中, 正常细胞多且呈弥漫状分布;结肠癌组织中正常细胞数少，呈浅黄色染色, 散在分布于细胞质;结肠黏膜中正常表达极少(见图3)。E-cadherin 的正常表达率在结肠癌旁正常组织、结肠癌组织中分别为72.5%和42.5%，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.2.3 Spearman相关分析：Id-2与E-cadherin在结肠癌组织中的阳性表达呈负相关(P<0.01，见表3)。

注：本文图片均由河北工程大学医学院组胚教研室单铁英提供。

图1 HE染色结果(200×)

A:癌旁正常组织；B:结肠癌组织；图2 Id-2蛋白在结肠癌组织中的表达(免疫组化,400×)

A：中-高分化结肠癌组织；B:癌旁正常组织；图3 E-cadherin蛋白在结肠癌组织中的表达(免疫组化,400×)

A:中-高分化结肠癌组织；B:癌旁正常组织

Fig 1 HE staining results (200×)

A: paracarcinoma normal tissue; B: colon cancer tissue;Fig 2 Expression of Id-2 protein in colon cancer tissue (SP 400×)

A: well and moderately-differentiated colon cancer tissue; B: paracarinoma normal tissue;Fig 3 Expression of E-cadherin protein in colon cancer tissue (SP 400×)

A: well and moderately -differentiated colon cancer tissue; B: paracarinoma normal tissue

表1 在不同结肠组织中Id-2蛋白的表达

Tab 1 Expression of Id-2 protein in different colon tissues

分组例数Id-2-++++++阳性率(%)χ2值P值癌旁正常组织4017117557.55.9520.015结肠癌组织4076151282.5

表2 在不同结肠组织中E-cadherin蛋白的表达

Tab 2 Expression of E-cadherin protein in different colon tissues

分组例数E-cadherin-±+阳性率(%)χ2值P值癌旁正常组织4011141572.57.3660.007结肠癌组织402312542.5

表3 Id-2与E-cadherin表达相关性分析

Tab 3 The correlation between Id-2 and E-cadherin

Id-2E-cadherin+-合计+201333-527合计251540

3 讨论

结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，中年以上的男性发病多见，但目前其发病机制尚不十分清楚，其发病可能与多种基因的高表达相关。有研究[6]表明，AL-DH1 在结肠癌组织中有一定高表达率，其高表达与结肠癌发生、发展和转移密切相关。Id-2是一种在细胞发育过程中广泛表达的转录调控因子,早期研究已表明Id-2分子参与细胞周期调控过程，且与一些脏器纤维化有关， 如肝纤维化、 肺纤维化等[7]。后来随着研究的深入, 发现其在肿瘤进展中表现出多样性，如在肿瘤的浸润、肿瘤的分化高低、侵袭转移行为以及不良预后等[8]。Itahana等[9]研究发现把Id-2基因导入SCp2鼠上皮细胞中，细胞的增殖明显减慢。在侵袭性较低、分化较高的乳腺癌细胞系中Id-2表达上调，且临床病理显示: 在乳腺原位癌中Id-2的表达水平明显高于具有浸润性的乳腺导管癌, 且随着组织学分级越高,Id-2蛋白的表达水平越低。这表明Id-2的表达水平与乳腺癌的分化程度呈正相关，而与乳腺癌的浸润性呈负相关。岳黎敏等[10]发现Id-2和明胶酶B(MMP9)在食管鳞癌的发生和浸润进展中存在协同促进作用，证实Id-2的靶基因NF-κB可调控MMP9的表达升高，从而降解基膜和细胞外基质，促使癌细胞穿越组织屏障,向肿瘤的周围或远处侵袭转移。沈晓东[11]研究表明，Id-2的缺失能抑制小鼠肠道肿瘤的发生，Id-2 在人类肠道肿瘤中可能发挥着促进肿瘤形成的作用。

E-cadherin属于钙依赖黏附蛋白家族成员之一，许多研究已证实E-cadherin 的表达减少或缺失与多种人类肿瘤的恶性表型相关。有研究[12]表明，上调E-cadherin表达能抑制食管癌的转移。田君等[13]发现 E-cadherin的阳性表达与组织学分级、国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期、肌层浸润深度、淋巴结转移呈负相关。近年来大量的研究结果发现[14-15]，许多恶性肿瘤的预后情况与E-cadherin的表达及功能障碍有密切相关性。有研究[16]表明，肝内胆管癌E-cadherin降低与侵袭、转移及不良预后密切相关，对判断患者预后有指导意义。景绍武等[17]研究表明，E-cadherin在鼻咽癌组织中的异常表达较正常对照组明显增加，E-cadherin异常表达者肿瘤分化程度低，更易出现淋巴结转移，因此可以作为鼻咽癌患者分化程度、淋巴结转移及临床分期的判断指标。Stighall 等[18]发现，Id-2 的表达与乳腺癌的分化程度呈正相关，与浸润深度、临床分期呈负相关，是预后的良性指标。但近年更多研究显示[19-20]，Id-2与乳腺癌临床分期呈正相关，是其预后的恶性指标，在乳腺癌细胞株中转染结构性表达的Id-2，可抑制E-cadherin的表达，并使癌细胞侵袭能力增强。岳黎敏等[21]研究发现，Id-2蛋白的表达与食管鳞癌的浸润深度、TNM分期有关，而与性别、年龄、分化程度及淋巴结转移无关；Id-2与E-cadherin表达呈负相关。进一步说明Id-2在食管鳞癌的发生和侵袭进展中起重要作用，其作用可能与调控E-cadherin的表达有关。

本研究结果显示，Id-2在结肠癌组织中阳性表达率较癌旁正常组织中阳性表达率高；E-cadherin在结肠癌组织中阳性表达率较癌旁正常组织中阳性表达率低。且Id-2 的表达水平与E-cadherin 的表达水平存在相关性，结肠癌组织中Id-2高表达可能是通过抑制E-cadherin的途径来促使肿瘤组织细胞的侵袭转移。这与岳黎敏等[21]的研究结果相同。但目前对于Id-2在不同肿瘤细胞中的功能及其分子学原理并没有完全阐明，需要更深入的研究。随着对Id-2作用机制的不断研究，其在判断肿瘤预后和治疗等方面的潜在价值更为重要。在细胞的表达水平上通过抑制Id-2基因的表达，可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，从而为临床诊断和治疗肿瘤提供新的科学方法，为肿瘤的精准治疗和靶向治疗提供新的理论。

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(责任编辑：马 军)

Expressions of inhibitor of differentiation-2 and E-cadherin in colon cancer

YUE Feng

Department of Second General Surgery, Handan Central Hospital, Handan 056001, China

Objective To research the expressions and relationship between inhibitory of differentiation -2 (Id-2) and epithelial cadherin (E-cadherin) in colon cancer.Methods HE staining was used to observe the histopathological changes in the cancer group and paracarcinoma normal group.Immunohistochemistry SP technique was used to detect the expressions of Id-2 and E-cadherin in cancer group and paracarcinoma normal group. Spearman correlation test was used to detect the correlation between Id-2 and E-cadherin.Results HE staining result in colon cancer tissue showed that cell differentiation was poor, pleomorphism and different size. Cells showed fake many layers, cell nucleus was large and karyokinesis, kytoplasm was few. The Immunohistochemistry showed the positive expression rates of Id-2 were 57.5% and 82.5% in the paracarcinoma normal group and cancer group.The positive expression rates of E-cadherin were 72.5% and 42.5% respectively in the paracarcinoma normal group and cancer group (P<0.05). Spearman correlation test showed that there was a negative correlation between Id-2 and E-cadherin (P<0.05).Conclusion The higher expression of Id-2 in colon cancer may be the way to achieve tumor invasion and metastasis through E-cadherin as a facilitator.

Colon cancer; Inhibitor of differentiation-2; Epithelial cadherin; Immunohistochemistry

岳峰,副主任医师，医学硕士，研究方向：胃肠肿瘤学研究。E-mail：doctoryuefeng@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.02.007

R735.3+4

A 文章编号：1006-5709(2017)02-0146-05

2016-11-08