孙慧叶，孙大庆，魏玉龙

牛乳中头孢噻呋残留检测方法的研究

孙慧叶1，*孙大庆2，魏玉龙2

（1.集贤县职业学校，黑龙江双鸭山155900；2.黑龙江八一农垦大学牡丹江食品与生物技术创新研究院，黑龙江牡丹江157000）

采用TTC法、微生物抑制纸片法和HPLC法对牛乳中头孢噻呋残留进行检测，比较不同检测方法的优缺点。结果表明，TTC法检测头孢噻呋残留的检出限为0.10mg/L；微生物抑制纸片法的检出限为0.01mg/L，符合限量要求；HPLC法的检出限为0.10μg/L。通过比较发现，TTC法简单、快速，不需要特殊设备，适合养殖场和基层使用；HPLC法灵敏度、准确度高，适合于实验室检测使用。

牛乳；头孢噻呋；微生物抑制法；高效液相色谱

随着抗生素在乳畜饲养业中的广泛应用，牛乳中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视。头孢噻呋是美国于20世纪80年代成功开发的兽医专用第3代头孢菌素，该药自上市以来，由于其优良的抗菌活性和药物代谢动力学特征，常用于奶牛感染的防治[1]。寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法可满足日趋严格的残留限量要求，对保障人们饮用牛乳的卫生和安全具有重要现实意义[2]。国外采用微生物抑制纸片法检测牛乳中抗生素残留起步较早[3]，而TTC法在国际上应用较少。我国2008年更新了TTC法检测牛乳中抗生素残留的国标方法，但还没有微生物抑制纸片法检测牛乳中抗生素残留的标准方法[4]。另外，由于高效液相色谱法（HPLC）的色谱条件不确定，也没有对头孢噻呋残留的HPLC检测方法研究[5-6]。研究采用微生物抑制纸片法、TTC法和HPLC法检测牛乳中的头孢噻呋残留，比较3种检测方法的最低检出量，探讨不同方法的优缺点，可为卫生安全地食用牛乳奠定一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及原料

藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌，由黑龙江八一农垦大学牡丹江食品与生物技术创新研究院微生物实验室保藏；牛乳，购于当地超市。

1.2 试剂及仪器

头孢噻呋钠标准品，纯度87.5%（批号K0330406）；乙腈（色谱纯）；三氯乙酸（色谱纯），购自Sigma公司。检测培养基：AM1琼脂（抗生素测定1号琼脂）；纯化及传代培养基（胰蛋白胨大豆琼脂）；营养琼脂；氯化三苯基四氮唑（TTC），购自上海生工生物工程公司。TGL-16B型离心机；510 Pump型液相色谱仪；JD100-3B型电子分析天平；RP-9082型电热恒温培养箱。

1.3 TTC法测定头孢噻呋残留

分别在牛乳中添加质量浓度为1.000，0.500，0.100，0.050，0.010，0.005 mg/L头孢噻呋的标准工作液，混匀后作为抗生素残留乳样。头孢噻呋残留的测定，参照GB/T 4789.27—2008进行。

1.4 微生物抑制纸片法测定头孢噻呋残留

1.4.1 菌悬液的制备

将藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌用普通营养肉汤复活，接种皿平板分离出单个菌落，挑取单个菌落接种TSA斜面，于37℃条件下培养18~ 24 h。取斜面菌苔制成0.5麦氏单位的菌悬液0.5 m L注入灭菌平皿内，加入10mL溶化后冷却至50℃左右的AM1琼脂，将琼脂与菌悬液充分混匀后保持水平使其凝固，置于42℃温箱中烘干20 min。分别在牛乳中添加不同质量浓度的头孢噻呋工作液（0.500，0.100，0.050，0.010，0.005mg/L），混匀后作为测定试样。

1.4.2 测定

取制备好的检定用平板，在平板底部做好标记，把滤纸片以适当间隔置于平板上，每个平板放置3个滤纸片，用镊子轻压使其固定，在每片滤纸上加100μL测定试样液，同时作阴性、阳性对照，静置10 min后，置于37℃条件下培养18 h后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。每份试样做2个平板的平行试验。阳性对照采用头孢噻呋的工作应用液，无添加头孢噻呋标准液的牛乳作为阴性对照。

1.5 HPLC法测定头孢噻呋残留

1.5.1 样品处理

用吸管准确吸取0.5mL牛乳样品于1.5mL微型离心管中，用超声波清洗器超声处理20min，使其均匀，加入0.5mL质量分数为10%的三氟乙酸，摇匀后放置20 min，放入离心机中，以转速12 000 r/min离心5 min，上层液体通过0.45μm水系微孔滤膜过滤，收集滤液，供高效液相色谱分析。

1.5.2 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（Waterssysmmetry），250mm× 4.6mm（I.D.），粒径5μm；流动相：质量分数为0.2%三氟乙酸∶乙腈（70∶30）；检验波长290 nm；流速1.0mL/min；进样量20μL；柱温40℃。

1.5.3 标准工作液曲线制备

头孢噻呋标准溶液配制：准确称取头孢噻呋标准品0.01 g于100 mL容量瓶中，用质量分数0.2%的三氟乙酸定容至刻度，配制成质量浓度为10 g/L的头孢噻呋标准溶液。

分别在牛乳中添加不同量的头孢噻呋标准工作液，混匀后作为测定试样，待测乳样的质量浓度分别为1.00，0.50，0.10，0.05，0.01 mg/L，然后分别过0.45μm水系醋酸纤维微孔滤膜，收集滤液供高效液相色谱分析。以保留时间定性、峰面积定量，绘制标准工作曲线，并确定最低检出量。

2 结果与分析

2.1 TTC法测定结果

TTC法测定样品中头孢噻呋残留结果见表1。

表1 TTC法测定样品中头孢噻呋残留结果

加入TTC指示剂的乳样准确培养30 min后，第1次观察结果如不显色者，再继续培养30 min，作为第2次观察，判断其显色状态。检样呈牛乳的本色时为阳性，如呈红色者为阴性。由表1可以看出，TTC法的头孢噻呋最低检出量为0.100mg/L。该法简便、快速，无需特殊设备，3~4 h可见报告，适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部门采用。

2.2 微生物抑制纸片法测定结果

如果检定平板中阳性对照的抑菌圈直径≥13mm，阴性对照无抑菌圈，可认为检出头孢噻呋残留。用游标卡尺测量测定试样的抑菌圈直径大小，计算平均值。

微生物抑制纸片法测定头孢噻呋残留结果见表2。

表2 微生物抑制纸片法测定头孢噻呋残留结果

微生物抑制纸片法的最低检出量为0.01 mg/L，试验所选用的3种测定用菌株对奶牛饲养业常使用的抗生素均有良好的敏感性。由表2可以看出，藤黄微球菌对头孢噻呋敏感，其他2种菌不敏感。

试验测定用平板琼脂的厚度直接影响抑菌圈直径的大小，琼脂厚的抑菌圈小，琼脂薄的抑菌圈大。9 cm的平板加注8 mL琼脂较合适，琼脂太薄，经37℃培养容易引起平板干燥裂开，影响结果判断。试验测定用平板检定用菌的浓度和加入量直接影响抑菌圈大小与清晰度，抑菌圈直径大小随着测定菌液浓度的增加而减小，但菌液浓度太小会导致抑菌圈模糊不清。选择0.5麦氏单位的菌液浓度，每个平板上加入0.5mL的菌液在抑菌圈大小与清晰度方面取得平行，效果最佳。采用微生物抑制纸片法检测牛乳中的抗生素，具有快速灵敏、仪器要求简单、成本低廉的优点，18~24 h即可得出结果，适应奶牛养殖场和基层实验室使用。

2.3 HPLC法测定结果

2.3.1 标准曲线

头孢噻呋标准品的液相色谱分析结果见图1，HPLC法测定头孢噻呋残留标准曲线见图2。

图1 头孢噻呋标准品的液相色谱分析结果

图2 HPLC法测定头孢噻呋残留标准曲线

由图1可知，头孢噻呋的保留时间为3.127 min，根据保留时间和标准品质量浓度，测定乳样中头孢噻呋的质量浓度，结果以峰面积归一法计算。以标准品质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果如图2所示。所得线性回归方程为Y= 753.02X+4.795 8，相关系数为0.997 9，线性关系良好。

2.3.2 头孢噻呋残留的最低检出限

将头孢噻呋标准液进行系列稀释，当上样质量浓度为0.005 mg/L时上样20μL，信号限与噪音限之比为2∶1~3∶1，因此确定最低检出量为0.10μg/L。

3 结论

比较不同检测方法测定头孢噻呋残留的最低检出限，高效液相色谱法检出量最低，为0.10μg/L，具有灵敏度高、准确度好、色谱峰分离优良等优点，但成本偏高，比较适合于实验室操作研究。其次是微生物抑制纸片法，最低检出限为0.01 mg/L，此法易操作，最低检出量较低，且成本不高，但培养菌种时间过长，不适合企业快速测定抗生素残留。TTC法的最低检出限最高，为0.10 mg/L，但TTC法简便、快速，无需特殊设备，3~4 h可见报告，比较适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部门采用。

[1]Marchetti M，Schwaiger I，Schmid E.Determination of benzylpenicillin，oxacillin，cloxacillin，and dicloxacillin in cows'milk by ion-pair high-performance liquid chromatography after precolumn derivatization[J].Fresenius'Journal of AnalyticalChemistry，2001（1）：64-67.

[2]Linage B，Gonzalo C，Carriedo JA，et al.Performance of blue-yellow screening test for antim icrobial detection in ovinemilk[J].Journal of Dairy Science，2007，90（12）：5 374-5 379.

[3]Wang J，Leung D.Analyses ofmacrolide antibiotic residues in eggs，rawmilk，and honey using both ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flightmass spectrometry and high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21（19）：3 213-3 222.

[4]Townsend D E，Irving R L，Naqui A.Comparison of the SimPlate coliform and Escherichia coli test with Petrifilm, three-tube MPN，and VRBA+MUGmethods for enumerating coliforms and E.coli in food[J].Journal of Food Protection，1998，61（4）：444-449.

[5]Gunasekera T S，Veal D A，Attfield P V.Potential for broad applications of flow cytometry and fluorescence techniques in microbiological and somatic cell analyses of milk[J].International Journal of Food Microbiology，2003，85（3）：269-279.

[6]Gunasekera TS，Attfield PV，Veal D A.A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk[J].Applied and Environmental Microbiology，2000，66（3）：1 228-1 232.◇

Research on the Detection Method of Ceftiofur Residue in Milk

SUN Huiye1，*SUN Daqing2，WEIYulong2
（1.Vocational School of Jixian County，Shuangyashan，Heilongjiang 155900，China；2.Mudanjiang Food and Biotechnology Innovation Institute，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Mudanjiang，Heilongjiang 157000，China）

The ceftiofur residues inmilk is determined by TTC，microbial inhibition and HLPCmethods.Advantages and disadvantagesof thesemethods are compared.The resultsshow theminimum detection limitof TTCmethod is 0.10mg/L.Theminimum detection limitofmicrobial inhibitionmethod is 0.01mg/L.Theminimum detection limitof HPLCmethod is 0.10μg/L.By comparing distrinctmethods，the TTCmethod is simple，fast and does not require special equipment and is particularly suitable for use in farms and grass roots，while HPLC is accurate，sensitive and suitable for laboratory.

milk；ceftiofur；microbial inhibitionmethod；high performance liquid chromatography

S859.84

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.016

1671-9646（2017）04a-0048-03

2017-03-23

孙慧叶（1980—），女，本科，中学一级教师，研究方向为食品教育与研究。

*通讯作者：孙大庆（1979—），男，博士，副研究员，研究方向为食品安全与检测。