刘肖++金晓娟+赵钊

[摘要] 目的 探讨人CCR9基因在乳腺癌细胞中的生物学功能。 方法 取扁桃体标本并逆转录为cDNA，扩增CCR9基因，连接至pEGFP-N2质粒，脂质体感染人MCF-7乳腺癌细胞。免疫印迹证实CCR9基因在MCF-7乳腺癌细胞表达。CCK-8方法检测MCF-7乳腺癌细胞增殖。 结果 免疫印迹证实构建pEGFP-N2-CCR9质粒及CCR9基因在MCF-7乳腺癌细胞中高效稳定表达，且CCR9基因能促进MCF-7乳腺癌细胞过度增殖和侵袭（P<0.05或P<0.01）。 结论 CCR9基因促进MCF-7乳腺癌細胞增殖和侵袭。

[关键词] CCR9；增殖；侵袭；乳腺癌细胞

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）35-0028-03

Effects of CCR9 on proliferation and invasion of breast cancer MCF-7 cells

LIU Xiao1 JIN Xiaojuan1 ZHAO Zhao2

1.Clinical Laboratory， The 117 Hospital of PLA， Hangzhou 310012， China； 2.Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To explore the biological function of human CCR9 gene in breast cancer cells. Methods Tonsil samples were taken and reverse-transcripted into cDNA. CCR9 gene was amplified， and was ligated to pEGFP-N2 plasmid. MCF-7 human breast cancer cells were infected by liposome. Immunoblotting confirmed the expression of CCR9 gene in MCF-7 breast cancer cells. CCK-8 assay was used to detect the proliferation of MCF-7 breast cancer cells. Results Western blot confirmed the construction of pEGFP-N2-CCR9 plasmid and efficient and stable expression of CCR9 gene in MCF-7 breast cancer cells. CCR9 gene could promote the over-proliferatioin and invasion of MCF-7 breast cancer cells（P<0.05 or P<0.01）. Conclusion CCR9 gene promotes the proliferation and invasion of MCF-7 breast cancer cells.

[Key words] CCR9； Proliferation； Invasion； Breast cancer cells

趋化因子是分子量为10 kDa左右的一类小分子蛋白，与相对应的趋化因子受体结合具有趋化白细胞的功能。趋化因子受体是具有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体。趋化因子受体9（CC chemokine receptor 9，CCR9）与其相对应的配体CCL25结合后与T淋巴细胞的趋化有关。趋化因子受体及其配体广泛参与机体细胞生长、分化、肿瘤细胞的生长和迁移等各种生理病理过程。趋化因子及受体的相互结合在肿瘤细胞的转移中扮演非常重要的作用，肿瘤细胞或免疫细胞表达特定的趋化因子受体，其受体与配体的相互结合引起肿瘤细胞的定向其靶器官的转移或免疫抑制细胞的招募，从而最终引起患者死亡。

乳腺癌的局部浸润和远处转移是乳腺癌患者预后的重要因素，对预测浸润和转移的研究具有重要的临床意义，其中趋化因子受体CCR9表达于大部分肿瘤细胞上，它的高表达会通过相应的细胞骨架信号通路来促进肿瘤细胞的过度增殖，侵袭和转移。近年来，趋化因子及其受体在乳腺癌远端转移中的作用引起了重视[1，3]。本研究通过在人MCF-7乳腺癌细胞过度表达CCR9，并分析与乳腺癌细胞增殖和侵袭相关功能指标，初步探讨CCR9在乳腺癌细胞中的功能。

1 材料与方法

1.1乳腺癌细胞和质粒

1640培养基购自杭州Invitrogen公司，人MCF-7细胞购自北京细胞库，pEGFP-N2质粒购自美国Clontech公司。

1.2试剂

限制性内切酶BglII和SalI（美国Promega公司，货号：R6085、R6051）；T4连接酶（美国Promega公司，货号：M1801）；胎牛血清（杭州四季青公司，货号：HB0205）；有基质胶的Transwell（美国BD公司，货号：356234）；人CCR9一抗（美国Abcam公司，货号：ab32556），大肠杆菌DH5α菌株购自杭州达科为公司，质粒抽提试剂盒（上海生工公司，货号B518191），Transwell细胞培养板购自美国Corning公司，引物由上海生工公司合成，CCK-8（CK04，日本同仁公司）。

1.3 方法

1.3.1 人MCF-7细胞的培养 细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，置于37℃的5% CO2孵育箱中培养。

1.3.2 构建pEGFP-N2-CCR9 质粒与转染MCF-7细胞株 取正常人手术切除扁桃体标本，提取总RNA，在引物前后各加入BglII和SalI酶切位点，Taq酶扩增CCR9的基因，取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳。将产物和pEGFP-N2质粒酶切，电泳回收并用T4连接酶连接，再将质粒进行细菌转化，摇菌并提取质粒。用1640培养基液稀释质粒和脂质体混匀并孵育20 min加入细胞培养液中，继续孵育培养。

1.3.3 免疫印迹检测CCR9蛋白表达 细胞裂解液提取细胞蛋白，100℃变性10 min并用免疫印迹电泳。用5%BSA将NC膜孵育0.5 h，加入β-actin或CCR9抗体与NC膜孵育1 h。用PBS溶液洗4次，加入HRP二抗，孵育0.5 h，PBS溶液洗4次，最后显影。

1.3.4 检测CCR9对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 MCF-7细胞和MCF-7-CCR9细胞接种于6孔板中，当细胞生长到1、2和3 d 时，每一孔加入10 μL CCK-8并于在培养箱中孵育45 min，然后酶标仪450 nm处检测吸光度值。

1.3.5 检测CCR9对乳腺癌MCF-7细胞侵袭的影响 将MCF-7或MCF-7-CCR9细胞分别接种到含有基质胶的Transwell板上。下面再加入完全培养基。培养箱中培养24 h，加100%甲醇固定小室5 min，用结晶紫染色30 min，最后清洗拍照。

2 结果

2.1 在MCF-7乳腺癌细胞过表达后CCR9蛋白的表达

免疫印迹显示CCR9和β-actin在特定位置有特异性条带。MCF-7-CCR9细胞组比MCF-7组颜色加深（封三图5），证实MCF-7-CCR9组中CCR9蛋白表达量比MCF-7组显著升高（封三圖5）。

2.2 过表达CCR9对乳腺癌MCF-7细胞增殖能力的检测

使用CCK-8实验在1、2和3 d测定细胞增殖并统计。结果显示CCR9对过表达CCR9的MCF-7细胞增殖显著上升（P<0.05）（封三图6）。

2.3过表达CCR9对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的检测

铺有基质胶的侵袭实验结果显示，过表达CCR9的MCF-7细胞侵袭能力显著上升（封三图7A、7B），MCF-7-CCR9及MCF-7或每组拍照5个视野并统计。结果显示CCR9对MCF-7乳腺癌细胞的侵袭能力显著上升（P<0.01，封三图7C）。

3 讨论

趋化因子为机体免疫细胞分泌的小分子活性蛋白，活化的免疫细胞可产生相对应的趋化因子。当趋化因子与其受体相互结合后，可促进细胞的归巢和造血组织和器官形成[4]。许多研究证实，趋化因子的受体及其配体的相互作用与肿瘤细胞的定向迁移有着紧密的联系[5-7]。肿瘤的转移是一个具有特异组织性长期过程，原发灶的肿瘤细胞侵袭、迁移到特定组织的分子相关机制的研究并不十分明确。目前有很多学说可以解释肿瘤转移：包括种子土壤学说等。但最近研究显示，在肿瘤发生发展过程中，趋化因子不仅参与了正常淋巴细胞的趋化，也参与了肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞的转移并非随意性，转移到特定器官的恶性肿瘤细胞常表现出高度的组织特异性[5]。大量研究证实特定分子能促进其增殖和侵袭，其中包括增强肿瘤细胞粘附到特定组织的内皮细胞上：如靶器官会释放大量的趋化因子，而靶器官分泌相对应的趋化因子则能招募对应表达相应趋化因子受体的肿瘤细胞招募并大量生长[7]。在肿瘤细胞定向迁移的过程中，趋化因子则会通过与表达相应趋化因子受体的肿瘤细胞相互作用，诱导肿瘤细胞的结构重排，促使肿瘤细胞能够穿透淋巴管的内皮细胞，并最终转移到远端器官，从而在远端器官定植，扩增，形成转移灶，导致患者的重要器官功能衰竭并死亡。

大量研究证实：趋化因子受体CCR9与对应配体趋化因子CCL25的结合在肿瘤细胞的组织特异性转移中扮演重要角色[8-10]，例如：Zhong Y等[11]研究发现，相比于正常的肺组织，CCR9在肺癌组织中高表达，而且CCR9的表达水平与肺癌肿瘤组织的大小，淋巴结远端转移以及TNM肿瘤分期密切相关，且高表达CCR9的肺癌病人比低表达CCR9的肺癌病人生存期短，且是肺癌病人预后的独立因子。体外实验也支持CCR9-CCL25相互作用对肺癌细胞侵袭和迁移能力上发挥重要作用，CCR9-CCL25之间的相互作用能够防止肺癌细胞过度凋亡，包括上调抗凋亡蛋白，下调凋亡蛋白，并且这种作用是依赖PI3K-/Akt 信号通路完成的，如果抑制PI3K-/Akt 信号通路，CCR9-CCL25之间的相互作用就会消失。此外，如果在运用慢病毒构建的CCR9干扰质粒，肺癌细胞则会过度的凋亡，体内小鼠动物模型中肿瘤的负担也会明显减小[12-14]。另外，CCR9在前列腺癌细胞上也有高度表达，CCR9高表达在LNCaP和PC3前列癌细胞上，而不表达或低表达于正常的前列腺上皮细胞，抗体阻断CCL25-CCR9的相互结合可以显著减低LNCaP和PC3前列腺癌细胞的近端侵袭与远端迁移，并且CCL25影响了胶原酶I和基质金属蛋白酶MMP-1，MMP-13，MMP-10，MMP-11，MMP-2，而不是通过MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-12，or MMP-14，说明CCL25-CCR9的相互作用还会通过影响肿瘤微环境中的基质金属蛋白酶的合成和降解来促进肿瘤的侵袭和远端转移[15]。

此外，Johnson-Holiday C等[16，17]应用半定量免疫组化证实，CCR9在中低分化的乳腺癌组织中的表达量高于正常乳腺导管组织，且与乳腺癌细胞的分化程度呈负相关。在细胞水平上，恶性MDA-MD-231乳腺癌细胞上的CCR9表达显著高于低恶性MCF-7，阻断CCR9显著降低乳腺癌细胞的侵袭和迁移。另外，CCR9-CCL25相互作用可以显著上调乳腺癌细胞微环境中基质金属蛋白酶的表达。随后研究也显示，CCL25趋化因子可促进乳腺癌细胞的过度增殖和抑制乳腺癌细胞的正常凋亡，可能是CCL25诱导PI3K信号通路等生存信号的活化来完成的。因此，CCL25也可能通过PI3K信号通路来调控肿瘤细胞的增殖、凋亡，侵袭和迁移。

Heinrich EL等[18，19]發现胰腺癌细胞能够分泌CCR9对应的趋化因子CCL25，并可通过自分泌和旁分泌的方式促进胰腺癌细胞的增殖和迁移。并用免疫组化方法检测了胰腺癌组织和癌旁组织CCR9和CCL25的蛋白表达，结果显示胰腺癌组织高度表达趋化因子受体CCR9，但癌旁组织中没有CCR9的表达，同样，胰腺癌组织高度表达趋化因子CCL25，但癌旁组织中没有CCL25表达。从而在胰腺癌组织中，高度表达的CCR9和CCL25相互作用进一步促进了胰腺癌的恶性生物学行为。此外，PANC-1胰腺癌细胞也分泌CCL25，并且用CCR9的抗体能够阻止胰腺癌细胞的侵袭。

Chamorro S等[20]构建了特异性的CCR9抗体，并发现在急性T淋巴细胞白血病的免疫缺陷小鼠模型中使用CCR9抗体会减少85%肿瘤的大小，在肿瘤组织部位也伴随着大量凋亡的肿瘤细胞和坏死区域，肿瘤细胞的增值率和肿瘤部位异常丰富的血供也明显减少。并且在体外T淋巴细胞白血病细胞加入CCR9抗体，会导致白血病细胞的溶解。同样，在黑色素瘤，乳腺癌小鼠肿瘤模型应用了此种抗体，小鼠的肿瘤体积都明显减少。

总之，我们的初步研究中成功构建了CCR9 的表达质粒，并证实CCR9在体外能够促进乳腺癌细胞的侵袭和增殖，为以后的小鼠功能学研究做了铺垫。

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（收稿日期：2016-08-04）