宋菲，杨发奋

(右江民族医学院附属医院，广西百色533000)

白芍总苷对糖尿病肾病大鼠的治疗作用及对肾组织TGF-β1、CTGF表达的影响

宋菲，杨发奋

(右江民族医学院附属医院，广西百色533000)

目的 观察白芍总苷(TGP)对糖尿病肾病(DN)大鼠的治疗作用，及其对肾组织TGF-β1、CTGF表达的影响，探讨其肾脏保护机制。方法 采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立DN模型，随机分成正常对照组、DN组及TGP低、中、高剂量组。正常对照组、DN组每天给予生理盐水灌胃，TGP低、中、高剂量组分别给予50、100、200 mg/(kg·d)TGP灌胃。实验8周末观察各组体质量、血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24 h尿蛋白定量，并行免疫组化法检测肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)与结缔组织生长因子(CTGF)的表达。结论 与正常对照组相比，DN组血糖升高、体质量下降、BUN和24 h尿蛋白定量明显升高(P均<0.01)。与DN组相比，TGP各剂量组大鼠BUN水平均降低，TGP高剂量组24 h尿蛋白定量减少(P均<0.01)；TGP中、高剂量组肾组织CTGF、TGF-β1表达均降低(P<0.05或<0.01)。结论 TGP灌胃对DN大鼠具有治疗作用，可改善肾功能，下调TGF-β1、CTGF在肾组织中的表达，从而发挥保护肾脏、延缓DN进展的作用。

白芍总苷；糖尿病肾病；大鼠；转化生长因子；结缔组织生长因子；大鼠

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)并发微血管改变的最常见并发症之一，是引起终末期肾病的主要原因，同时也是DM患者的主要死亡原因之一。DN进展可能与持续性的低浓度炎症反应和细胞外基质(ECM)不断累积有关[1]，转化生长因子β1(TGF-β1)与结缔组织生长因子(CTGF)在DN的发生发展中起重要作用。TGF-β1可刺激成纤维细胞生成ECM、降低多种ECM降解酶的活性、诱导肾小管上皮细胞-间充质细胞转化，促使肾小球硬化的发生[2]；激活肾小管上皮细胞启动自噬，促使肾小管变性，导致肾间质纤维化[3]。在正常肾脏组织内，CTGF表达很低或无表达；在病理状态下，CTGF可促进成纤维细胞增生、移动、黏附，加快ECM增生及小管上皮细胞转化[4]。在CTGF启动子的激活过程中，TGF-β1是最重要的激活因子，可通过Smad3介导而诱导CTGF表达[5]。另一方面，CTGF作为TGF-β1的下游信号因子反作用于TGF-β1，加速其致纤维化进程[6]。白芍总苷(TGP)是从白芍干燥根中提取的混合物，具有抗炎、抗氧化、免疫活性调节等作用。2015年6～8月，我们对DN模型大鼠给予不同剂量TGP进行治疗，观察其对肾组织TGF-β1、CTGF表达的影响，探讨TGP对DN大鼠的肾脏保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠60只，体质量(230±10)g，由右江民族医学院实验动物室提供，适应性喂养1周。TGP(宁波立华制药有限公司，用前溶于1%的羧甲基纤维素钠溶液中)，STZ(北京博爱港商贸有限公司)；尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)检测试剂盒(上海科华生物工程有限公司)，尿白蛋白、尿蛋白检测试剂盒(武汉博士德有限公司)；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、兔抗大鼠CTGF多克隆抗体(武汉博士德有限公司)。

1.2 模型制备与分组处理 随机选取50只大鼠，给予STZ 60 mg/kg腹腔注射。其余10只作为正常对照组，腹腔注射等量生理盐水。DN造模成功的标准：STZ腹腔注射72 h后空腹血糖13.8～25 mmol/L，2周后24 h尿白蛋白排泄率高于对照组，且24 h尿蛋白定量大于造模前的50%。排除实验过程中死亡的大鼠，将造模成功的大鼠随机分成DN组及TGP低、中、高剂量组各9只。TGP低、中、高剂量组分别给予TGP 50、100、200 mg/kg灌胃，按大鼠体质量计算TGP剂量后溶于2 mL的1%羧甲基纤维素钠溶液中；正常对照组和DN组给予1%的羧甲基纤维素钠溶液2 mL灌胃，均1次/d。

1.3 指标观察方法

1.3.1 体质量、血糖及肾功能检测 每周使用DT-2000型电子天平检测大鼠体质量，使用血糖仪监测大鼠空腹血糖。实验8周后，禁食不禁水，留取各组大鼠24 h尿液，使用日本Olympus AU-2700型全自动生化分仪检测24 h尿蛋白定量;取尾静脉血，检测BUN、SCr。

1.3.2 肾组织TGF-β1、CTGF表达检测 采用免疫组化方法。取大鼠肾组织置于4%多聚甲醛中固定，常规梯度脱水、石蜡包埋后，切4 μm厚切片，常规脱蜡、水化、组织抗原修复，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育10 min。依次加入一抗、二抗，37 ℃静置30 min，PBS冲洗。DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。每只大鼠制片3张，采用Image-Pro Plus 6.0彩色病理图像分析软件。计算每张片上每个肾小球阳性染色的积分光密度(IOD)，取平均值。

2 结果

2.1 各组体质量、血糖及肾功能比较 与正常对照组相比，DN组体质量降低、血糖升高、24 h尿蛋白定量升高、BUN升高(P均<0.01)。与DN组比较，TGP各剂量组血糖、体质量、Scr均无统计学差异，TGP各剂量组BUN均降低(P均<0.01)；TGP高剂量组24 h尿蛋白定量较DN组降低(P<0.01)，低、中剂量组24 h尿蛋白定量与DN组比较无统计学差异。见表1。

表1 各组体质量、血糖及肾功能比较±s)

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与DN组比较，△P<0.01。

2.2 各组肾组织TGF-β1、CTGF表达比较 与正常对照组相比，DN组肾组织TGF-β1、CTGF表达升高(P均<0.01)，TGP中、高剂量组TGF-β1、CTGF表达降低(P均<0.01)；与DN组比较，TGP中、高剂量组CTGF、TGF-β1表达降低(P<0.05或<0.01)；TGP低剂量组TGF-β1、CTGF表达降低，但差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组肾组织TGF-β1、CTGF表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与DN组比较，*P<0.05，△P<0.01。

3 讨论

DN早期主要表现为持续微量白蛋白尿、肾小球基底膜增厚、系膜基质增多，继而导致肾小球硬化及肾间质纤维化。研究发现，肾小球纤维化和肾间质纤维化是慢性肾脏疾病进展成为终末期肾病的共同通路[7]。DM患者体内炎症因子、黏附因子及趋化因子表达增加，巨噬细胞在以上因子的诱导下活化，继而产生多种炎症因子和细胞因子，造成肾小球的血管内皮细胞损伤、基底膜受损、系膜细胞增生、系膜基质增多，使肾损伤不断进展，最终导致肾小球纤维化。在促纤维化细胞因子的作用下，肾小球系膜区的ECM增多，肾小球硬化随之产生，肾脏逐渐失去正常的生理功能。TGF-β1在成纤维细胞增殖、上皮细胞分化及ECM合成等环节中起重要作用，能够促进胶原与基质形成并抑制其降解。细胞因子CTGF是重要的促组织纤维化蛋白，在结缔组织的合成与降解、成纤维细胞的增殖、迁移、黏附以及ECM表达均起重要作用[8]。Gore-Hyer等[9]发现，CTGF可通过介导人系膜细胞表达胶原蛋白使ECM沉积，诱导糖蛋白表达使上皮细胞转化为间皮细胞，在DN肾纤维化进程中发挥重要作用。CTGF是介导TGF-β1的早期即刻基因[10]，CTGF作为其下游信号因子发挥促纤维化作用，TGF-β1和CTGF在许多纤维化疾病中表达同步增高。近期研究表明，通过抑制TGF-β1/Smads信号通路及其下游CTGF因子的表达，可能改善DM大鼠症状并保护其肾组织[11]。本研究显示，与正常对照组相比，DN组肾组织中TGF-β1、CTGF表达增加，提示二者在肾组织中的表达与DN的肾脏病理改变密切相关。

TGP为毛莨科植物白芍内提取成分，其主要成分为芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等，具有镇痛、镇静、抗惊厥、抗炎、保肝以及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用。动物实验表明，TGP能抑制DM大鼠肾组织中炎症因子及细胞因子的表达，起到保护肾脏的作用[12，13]。Wu等[14]认为，TGP可减少DM大鼠AER、抑制肾组织ECM蛋白Ⅳ型胶原的产生，对DM大鼠的肾小管间质损伤起到明显的治疗作用。袁亮等[15]研究表明，TGP可降低DM大鼠的24 h尿白蛋白排泄率，抑制肾组织ECM蛋白Ⅳ型胶原产生；其机制可能是通过抑制TGF-β1表达来抑制肾小管间质细胞转化过程，从而延缓DN的纤维化进程。邹晓荣等[16]报道，DN患者在常规治疗的基础上加用TGP胶囊治疗6个月后，患者24 h尿蛋白定量减少，肌酐清除率上升，生活质量明显改善。

本研究显示，对DN大鼠采用不同剂量TGP干预治疗后；BUN均下降,高剂量组24 h尿蛋白定量减少。推测TGP可能通过减轻炎症反应、减轻足细胞的损伤，从而减少蛋白尿的排泄，改善DN大鼠的肾功能。与正常对照组相比，DN组Scr虽有所升高，但差异无统计学意义，可能与检测前大鼠长时间禁食导致代谢减少有关，也可能是实验观察时间较短，大鼠肾功能的丧失尚不足以导致Scr明显降低。免疫组化结果提示，中、高剂量组肾组织TGF-β1、CTGF较DN组下降，提示TGP可下调TGF-β1、CTGF表达，从而起到保护肾脏的作用。表明TGP可以减少尿蛋白，降低血清BUN，达到改善肾功能、保护肾脏的作用，其机制可能与下调TGF-β1、CTGF表达有关。

综上所述，TGP对DN大鼠具有治疗作用，可改善肾功能，下调TGF-β1、CTGF在肾组织中的表达，起到保护肾脏、延缓DN进展的作用

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杨发奋(E-mail: wotanlong@163.com)

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A

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2016-10-12)