肖楠，徐党辉，潘志尧，姚志峰

(1江苏联合职业技术学院南京卫生分院，南京210038；2南京中医药大学第一附属医院；3浙江大学医学院；4南京医科大学第二附属医院)

荜茇酰胺对人肺腺癌A549细胞辐射敏感性的影响

肖楠1，徐党辉2，潘志尧3，姚志峰4

(1江苏联合职业技术学院南京卫生分院，南京210038；2南京中医药大学第一附属医院；3浙江大学医学院；4南京医科大学第二附属医院)

目的 探讨荜茇酰胺对人肺腺癌A549细胞辐射敏感性的影响。方法 体外培养人肺腺癌A549细胞，分别加入1、2、4、8、16 μmol/L荜茇酰胺作用24、48、72 h，采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率，筛选出对A549细胞毒性最低的浓度。将A549细胞分为空白对照组、荜茇酰胺组、单纯照射组以及联合处理组，空白对照组不做处理，荜茇酰胺组加入1 μmol/L荜茇酰胺，单纯照射组给予8 Gy X线照射，联合处理组先给予1 μmol/L荜茇酰胺作用48 h后再给予8 Gy X线照射。采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率，流式细胞术观察各组细胞周期及凋亡情况。结果 不同浓度荜茇酰胺处理A549细胞24、48、72 h后，1 μmol/L荜茇酰胺的细胞增殖抑制率均低于其他各组(P均<0.05)。联合处理组48 h时的细胞增殖抑制率高于单纯照射组和荜茇酰胺组(P均<0.05)。联合处理组G0/G1期细胞比例较单纯照射组增多,而S期细胞比例减少，细胞凋亡率高于单纯照射组(P均<0.05)。结论 1 μmol/L荜茇酰胺能够增加A549细胞对X射线的辐射敏感性，其机制可能与促进细胞增殖抑制、诱导细胞凋亡、引起细胞G0/G1期阻滞有关。

荜茇酰胺；肺腺癌；X射线；辐射敏感性；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡

荜茇酰胺是从胡椒科植物荜茇的根中提取的酰胺类化合物，具有镇痛、镇静、抗炎、抗焦虑、抗抑郁、抗肿瘤等多种生理及药理活性[1～8]。我们的前期研究发现，荜茇酰胺对三阴性乳腺癌细胞具有辐射增敏效应[9]。2015年7～10月，我们观察了荜茇酰胺对肺腺癌A549细胞辐射敏感性的影响，为荜茇酰胺作为辐射增敏剂扩大应用范围提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌A549细胞由东南大学吴健雄重点实验室惠赠。荜茇酰胺用二甲基亚砜配成5 mmol/L的储备液，过滤除菌，-20 ℃保存。使用时用无血清培养基逐级稀释至设定的实验浓度。高糖DMEM培养基、0.25%胰酶、PBS、青-链霉素溶液为Gibco公司产品；胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所；二甲基亚砜、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为南京凯基公司产品；余为国产分析纯试剂。

1.2 细胞培养 取A549细胞加入含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养液，置于含5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，单层贴壁生长，每2～3日传代1次。取对数生长期细胞，加入0.25%胰酶消化，制成5×104/mL的单细胞悬液。

1.3 荜茇酰胺对A549细胞毒性最低浓度的确定 将A549细胞悬液接种到96孔板。培养24 h后，更换培养液，分别加入1、2、4、8、16 μmol/L荜茇酰胺250 μL，每个浓度设5个复孔。继续培养24、48、72 h。于实验终止前4 h加入CCK8试剂10 μL，置培养箱内培养4 h，于450 nm波长处用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度OD值。另设空白对照组，不施加任何处理因素。细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值)/(空白对照组OD值)]×100%。取细胞增殖抑制率最低的浓度用于后续实验。

1.4 荜茇酰胺对A549细胞辐射敏感性的影响观察

1.4.1 细胞分组与处理 将A549细胞接种于6孔板(用于检测细胞周期和细胞凋亡)和96孔板(用于检测细胞增殖抑制率)，分为荜茇酰胺组、单纯照射组、联合处理组，每组设5个复孔。荜茇酰胺组加入毒性最低浓度的荜茇酰胺；单纯照射组给予X线照射，辐射源为直线加速器产生的6 MV高能X线，源皮距100 cm，剂量率300 cGy/min，照射野20 cm×20 cm，细胞面覆盖1.5 cm补偿膜，常温下照射，吸收剂量为8 Gy；联合处理组先给予毒性最低浓度的荜茇酰胺作用24 h后，再给予8 Gy X线照射，继续培养24 h。另设空白对照组，不施加任何处理因素。

1.4.2 细胞增殖抑制率检测 先给予毒性最低浓度的荜茇酰胺作用24 h后，再给予8 Gy X线照射，继续培养24 h。采用CCK8法检测细胞增殖抑制率，具体方法同1.3。

1.4.3 细胞周期和细胞凋亡检测 取3组细胞分别加入0.25%胰酶消化，离心收集细胞。取一部分细胞加入70%冰乙醇固定，4 ℃过夜，依次加入1 mg/mL核糖核酸酶10 μL、0.5 mg/mL碘化丙啶(PI)50 μL，4 ℃避光染色30 min，上流式细胞仪检测细胞周期；另一部分细胞经AnnexinV-FITC和PI双染色，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 荜茇酰胺对A549细胞毒性最低浓度 不同浓度荜茇酰胺处理A549细胞24、48、72 h后，1 μmol/L荜茇酰胺的细胞增殖抑制率均低于其他各组(P均<0.05)，1 μmol/L荜茇酰胺对A549细胞的增殖抑制作用最弱。见表1。

表1 不同浓度荜茇酰胺对A549细胞的增殖抑制率比较

注：与1 μmol/L组比较，*P<0.05。

2.2 荜茇酰胺联合X射线照射对A549细胞增殖的影响 空白对照组、荜茇酰胺组、单纯照射组和联合处理组的细胞增殖抑制率分别为0、11.25%±1.11%、13.32%±1.52%、43.46%±2.73%，联合处理组高于其他各组(P均<0.05)。

2.3 各组G0/G1期、S期细胞比例及细胞凋亡率比较 联合处理组G0/G1期细胞比例较单纯照射组增多，而S期细胞较单纯照射组减少(P均<0.05)；联合处理组细胞凋亡率高于单纯照射组(P均<0.05)。见表2。

3 讨论

研究表明，荜茇酰胺可显著抑制膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病细胞等多种实体瘤和血液系统肿瘤的生长增殖[2]，诱导肿瘤细胞凋亡[10，11]，并能干扰细胞周期进程[11，12]，而肿瘤细胞的辐射敏感性与细胞凋亡以及细胞在增殖周期各时相的分布密切相关。本研究结果表明，荜茇酰胺在体外能抑制肺腺癌A549细胞增殖，且随浓度增加、作用时间延长，其抑制作用逐渐增强。

表2 各组细胞G0/G1期、S期细胞比例及细胞凋亡率比较±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与单纯照射组比较，△P<0.05。

不恰当的细胞增殖是肿瘤的特征之一，因此不少抗肿瘤药物作用于细胞周期调控点，以此减少肿瘤细胞的分裂增殖。细胞的分裂在调节细胞功能中发挥重要作用。Jyothi等[11]报道，荜茇酰胺处理过的小鼠胚胎癌细胞被阻滞在G1期。Kong等[12]发现，不同浓度的荜茇酰胺作用于前列腺癌PC-3细胞后，相当一部分细胞被阻滞于G2/M期，且PC-3细胞的生长抑制作用与G2/M期阻滞相关。本研究显示，荜茇酰胺能使A549细胞阻滞于G0/G1期，表明荜茇酰胺作用后的细胞倍增时间明显延长，处于静止期(G0期)的细胞明显增多，细胞周期进程明显减缓，最终使细胞增殖速度减慢，凋亡明显增多，细胞凋亡前选择性的G1期阻滞预示着DNA合成阶段受阻。本研究筛选出荜茇酰胺对A549细胞毒性最低的浓度为1 μmol/L，将其与X射线联合作用后，明显增加了细胞增殖抑制率，即在无明显毒性作用的剂量下提高了A549细胞的辐射敏感性。荜茇酰胺能使A549细胞阻滞于G0/G1期，同时明显降低S期细胞比例，而G2/M期细胞没有明显变化，提示荜茇酰胺可引起A549细胞周期阻滞，通过改变细胞周期时相的分布而发挥辐射增敏作用。荜茇酰胺先作用于A549细胞后再进行一定剂量的X线照射，同样出现明显的G0/G1期阻滞效应，并且消除了X线对细胞轻度的G2/M期阻滞作用。说明荜茇酰胺的辐射增敏机制是通过增加凋亡最敏感的G0/G1期细胞比例，降低辐射抗拒的S期细胞，而不是增加辐射敏感的G2/M期细胞比例实现的。

细胞受到辐射后凋亡是其主要的死亡形式，肿瘤对放疗抵抗的原因之一就是肿瘤细胞对凋亡产生了抵抗性[13]。流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明，荜茇酰胺除自身能诱导肺腺癌A549细胞凋亡外，还能增强辐射对肺腺癌细胞凋亡的诱导作用，联合处理组较单纯照射组细胞凋亡率显著增加。前文述及荜茇酰胺使细胞周期阻滞于G1期，因处于该期的细胞受照射后未能完全修复，易发生凋亡，因此凋亡细胞比例明显提高。一般而言，凋亡反应的增加预示细胞对于辐射更加敏感[14，15]。本实验联合处理组的细胞凋亡率较单纯照射组显著增加，说明荜茇酰胺很可能增加了辐射所致的细胞凋亡。Kong等[12]研究发现，用荜茇酰胺处理的前列腺癌PC-3细胞出现空泡化以及染色体浓集现象等细胞凋亡的典型表现，并检测到Caspase-3活性升高，证实荜茇酰胺能促进前列腺癌细胞的凋亡，进一步研究发现荜茇酰胺未明显改变Bax的表达，但使Bcl-2表达下降、Bax/Bcl-2比值下降，而肿瘤细胞Bax/Bcl-2的表达程度与其辐射敏感性呈正相关[16]。荜茇酰胺是否也通过凋亡抑制蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相对表达量的改变诱导A549细胞凋亡的发生，进而表现出辐射增敏效应值得进一步研究。

研究发现，荜茇酰胺对多种肿瘤细胞株的增殖有明显抑制作用的同时，对正常细胞的增殖无影响或影响很小[2，5]。本研究显示，荜茇酰胺明显抑制A549细胞增殖，而且有效抑制浓度处于微摩尔水平，剂量很小，毒性反应可能较轻。理想的放射增敏剂应能显著增加肿瘤细胞的放疗疗效，而对正常组织没有或很少有不良反应，从这一点来看，荜茇酰胺具备明显优势，值得进一步深入研究。

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Effect of piplartine on radio-sensitization of human pulmonary adenocarcinoma A549 cells

XIAONan1,XUDanghui,PANZhiyao,YAOZhifeng

(1NanjingHealthSchoolofJiangsuUnionTechnicalInstitute,Nanjing210038,China)

Objective To investigate the effect of piplartine on radio-sensitization of human pulmonary adenocarcinoma A549 cells.Methods A549 cells cultured in vitro were treated with 1, 2, 4, 8 and 16 μmol/L piplartine for 24, 48 and 72 h. CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibition of piplartine on A549 cells in each group and then we selected the minimum concentration which had no obvious toxic effect on A549 cells. A549 cells were divided into four groups: the control, piplartine group, radiation group and the combination treatment group. The control group was not treated. The piplartine group was given the concentration of 1 μmol/L piplartine, the radiation group was given X-ray radiation of 8 Gy alone, and the combination treatment group was given the concentration of 1 μmol/L piplartine for 48 h, then was exposed to X-ray radiation of 8 Gy. CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibition of piplartine on A549 cells in each group. Cell cycle and apoptosis of A549 cells were analyzed by flow cytometry (FCM).Results After being treated with piplartine for 24, 48 and 72 h, the proliferation inhibition rate of the piplartine group was lower than that of the other groups (allP<0.05). The proliferation inhibition in the combination treatment group was higher than that of the radiation group and the piplartine group at 48 h (allP<0.05). The percentage of cells in the G0/G1phase of the combination treatment group was significantly increased, and was decreased in the S phase, and apoptosis rate was also higher than that of the radiation group (P<0.05).Conclusion Piplartine at the concentration of 1 μmol/L can enhance the radio-sensitivity of A549 cells, which may be associated with the enhancement of radiation-induced inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis as well as cell arrest in G0/G1phase.

piplartine; pulmonary adenocarcinoma; X-ray; radio-sensitization; cell proliferation; cell cycle; apoptosis

肖楠(1984-)，男，硕士，讲师，主要研究方向为胸部影像诊断学。E-mail： 15996301027@126.com

姚志峰(1986-)，男，硕士，主治医师，主要研究方向为肿瘤的放射治疗。E-mail： yzf058565@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.004

R734.2

A

1002-266X(2017)06-0013-04

2016-08-05)