江金垚，陈亚丽

(1天津医科大学第二医院，天津300211；2河北医科大学第三医院)

香叶醇对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

江金垚1，陈亚丽2

(1天津医科大学第二医院，天津300211；2河北医科大学第三医院)

目的 研究香叶醇对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移的影响，并探讨其分子机制。方法 取雄性SD大鼠的胸腹主动脉血管，采用贴块法分离、培养VSMCs。将细胞分为阴性对照组、对照组、低浓度组及高浓度组，阴性对照组加入无FBS的DMEM培养液，对照组加入含10% FBS的DMEM培养液，低浓度组加入含10% FBS的DMEM培养液及香叶醇50 μmol/L，高浓度组加入含10% FBS的DMEM培养液及香叶醇400 μmol/L。采用MTT法检测各组细胞增殖情况，细胞划痕实验观察细胞迁移能力，Western blot法检测Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路的表达。结果 对照组细胞增殖的OD值较阴性对照组升高；低、高浓度组OD值低于对照组，且高浓度组低于低浓度组(P均<0.05)；对照组迁移细胞数较阴性对照组增加，低、高浓度组迁移细胞数少于对照组，且高浓度组少于低浓度组(P均<0.05)；对照组Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路激活较阴性对照组明显；低、高浓度组与对照组相比Ras-MEK1/2- ERK1/2信号通路激活受抑制，且高浓度组较低浓度组抑制效应更明显(P均<0.05)。结论 香叶醇可抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移，其机制之一可能是抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的激活。

香叶醇；血管平滑肌细胞；细胞增殖；细胞迁移；Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路；丝裂原活化蛋白激酶

冠心病患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后易发生支架内再狭窄(ISR)。PCI术后血管平滑肌的增殖与迁移形成新生内膜，加上各种炎性细胞募集，细胞外基质合成，最终导致ISR发生。尽管药物洗脱支架的应用已大幅减少ISR风险，但其发生率仍超过10%[1]。香叶醇是一种植物单萜醇，具有抗细胞增殖[2]、诱导细胞凋亡[3]、阻滞细胞周期[4]、抗氧化应激[5]、降低血浆TG和TC[6]及抑制脂肪代谢相关酶表达[7]等作用，可发挥抗动脉粥样硬化的心血管保护作用。Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的经典通路之一，对细胞信号传导、细胞周期调控、细胞增殖和迁移起重要作用。2016年，我们观察了香叶醇对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及迁移的影响，并检测Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路，以Ras表达增加及MEK1/2、ERK1/2磷酸化程度增加达到统计学差异为激活状态标准，观察其激活情况，探讨其可能的分子机制，为预防和治疗ISR提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠，体质量80～100 g，由河北医科大学实验动物中心提供。香叶醇(Sigma公司，美国)；胎牛血清(FBS)；DMEM培养基；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；MTT试剂盒(Millipore，美国)；抗Ras、MEK1/2、P-MEK1/2、ERK1/2、P-ERK1/2、β-actin抗体(Cell Signaling Technology，美国)，抗兔第二抗体(Rockland公司，美国)。

1.2 VSMCs的分离和培养 将大鼠常规处死，取胸腹主动脉血管，分离血管周围组织，纵向剖开血管，剪成表面积0.5～1 mm2的组织块，平铺于含FBS的无菌培养瓶底部，37 ℃、5% CO2培养箱孵育7 d，待细胞融合至80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3～6代细胞进行实验。

1.3 细胞分组与处理 细胞生长至80%融合后，换用无FBS的DMEM培养液饥饿培养16 h，使细胞处于静止期。将细胞分为4组，阴性对照组继续用无FBS的DMEM培养液培养，对照组加入含10% FBS的DMEM培养液，低浓度组加入含10% FBS的DMEM培养液+香叶醇50 μmol/L，高浓度组加入含10% FBS的DMEM培养液+香叶醇400 μmol/L。

1.4 细胞增殖能力观察 采用MTT法。四组细胞处理24、48 h后，每孔加入MTT 5 mg/mL 40 μL，37 ℃、5% CO2孵育4 h，弃培养液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，振荡10 min，置酶标仪上，于490 nm波长处测各孔吸光度OD值。

1.5 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。四组细胞处理24、48 h后，用无菌吸头在细胞生长至80%融合的6孔板上划一细痕。PBS洗去被刮下的细胞，继续培养24 h，低倍镜下观察细胞迁移情况。任取3个视野计数迁移细胞数量。

1.6 Ras-MEK1/2-ERK1/2相关通路蛋白检测 采用Western blot法。四组细胞培养48 h后，PBS洗涤，刮取细胞，加入PBS，离心弃上清。加入细胞裂解液裂解细胞，再以超声波粉碎细胞，离心收集上清。加入蛋白酶抑制剂，按照BCA试剂盒说明测定上清液中的蛋白浓度，收集上清蛋白样品-80 ℃保存待用。配制12% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶，蛋白样品与2×上样缓冲液1∶1混合，沸水浴10 min，上样至凝胶孔，进行SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳，5%脱脂奶粉封闭2 h，依次加入一抗(1∶200)、二抗(1∶2 000)，室温孵育，TBST洗膜，加发光剂显色，Bio-Rad Geldoc 2000图像分析仪进行扫描分析。以Ras蛋白与内参β-actin的比值表示Ras的相对表达量，以磷酸化MEK通路(P-MEK)蛋白与总的MEK通路(T-MEK)蛋白的比值表示MEK的磷酸化程度，以磷酸化ERK通路(P-ERK)蛋白与总的ERK通路(T-ERK)蛋白的比值表示ERK的磷酸化程度。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 与阴性对照组比较，对照组OD值较阴性对照组升高；低浓度组和高浓度组OD值低于对照组，且高浓度组低于低浓度组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖能力比较±s)

注：与阴性对照组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05；与低浓度组比较，cP<0.05。

2.2 各组细胞迁移数比较 阴性对照组、对照组、低浓度组、高浓度组细胞迁移数分别为(6.28±1.18)、(57.39±4.81)、(36.11±4.20)、(12.83±2.41)个。对照组较阴性对照组增加，低、高浓度组较对照组减少，高浓度组少于低浓度组(P均<0.05)。

2.3 各组Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路激活水平比较 与阴性对照组比较，对照组Ras信号通路激活明显，高浓度组和低浓度组Ras信号通路与对照组相比激活受抑制，且高浓度组较低浓度组抑制效应更明显(P均<0.05)。同样，对于Ras信号通路下游的MEK1/2和ERK1/2信号通路，对照组发生明显磷酸化，低、高浓度组磷酸化受抑制，且高浓度组较低浓度组抑制效应更明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组Ras信号通路表达及MEK1/2、ERK1/2信号通路磷酸化程度比较±s)

注：与阴性对照组比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05；与低浓度组比较，cP<0.05。

3 讨论

PCI术后ISR的发生机制较复杂，目前一般认为是由于球囊扩张破坏粥样硬化斑块，致血小板黏附、聚集和激活，活化的血小板释放多种细胞因子、趋化因子和生长因子，引发平滑肌细胞增生、白细胞募集和凝血瀑布激活，平滑肌细胞由收缩状态 转变为合成状态，在血管中膜开始增殖，并逐渐由中膜迁移到内膜，随后形成新生内膜，各种炎性细胞如单核细胞、T细胞和少量B细胞在这一过程中被募集，再加上透明质酸、胶原蛋白等细胞外基质的合成，最终导致ISR的发生[8,9]。ISR实际上是局部血管损伤后的再修复过程，这个过程涉及血管弹性回缩、血栓形成、炎症因子活化以及血管平滑肌细胞增殖和凋亡[10]。

天然香叶醇能够通过抑制细胞迁移、下调增殖细胞核抗原(PCNA)表达、抑制Ras-ERK信号通路磷酸化、抑制活性氧生成等途径抑制细胞增殖以及抑制B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因家族蛋白等途径诱导细胞凋亡[2，11]，抑制肿瘤细胞生长。最新研究显示，香叶醇可通过减少血浆TG、TC及抑制脂肪代谢相关酶表达发挥其抗动脉粥样硬化的作用[6，7]。本研究发现，香叶醇能显著抑制大鼠VSMCs增殖和迁移，且随着浓度增高，抑制效应更趋明显。同时发现，香叶醇能抑制增殖相关Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的激活，且随浓度增高，抑制效应更明显。Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路是MAPK的经典通路，在细胞信号传导、细胞周期调控中起重要作用[12]。在这一通路中，Ras是上游信号蛋白，引导细胞周期由G1期进入S期，而ERK1/2对细胞增殖和迁移至关重要[13]。多种细胞因子、生长因子、炎症因子等刺激信号，激活Ras原癌基因所介导的Ras-MEK1/2-ERK1/2信号传导通路，引起ERK1/2发生磷酸化激活，导致细胞周期蛋白Cyclin D等合成增加，引起蛋白合成和细胞增殖[14]。

综上所述，香叶醇具有抑制大鼠VSMCs增殖和迁移的作用，其机制与抑制增殖相关Ras-MEK1/2-ERK1/2信号通路激活有关,为香叶醇用于预防ISR提供了理论依据。

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