周 翠

（东阿县林业局，山东 东阿 252200）

粘帚霉（Gliocladiumsp.），属半知菌门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘帚霉属，是一种分布广泛的土壤习居菌和重寄生菌，具有生长速度快、产孢量大、寄主范围广、寄生能力强、拮抗机制多样等优点，被认为是目前已发现的拮抗微生物中极具潜力的生防因子之一[1-2］。粉红粘帚霉（G.roseum，无性阶段拉丁文名称为Clonostachys rosea）是得到广泛的研究和应用的粘帚霉之一，丝状真菌，在生长周期内可以产生3种繁殖体，包括菌丝体、分生孢子和厚垣孢子[3-5］。粉红粘帚霉的生存环境十分广泛，热带雨林，温带，靠近北极地区以及世界上的沙漠地带均有粉红粘帚霉分布。据报道，耕地、草地、荒野、淡水、海滩以及盐碱地都可能分离到粉红粘帚酶[6］。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：粉红粘帚霉分离自于山东省潍坊市临朐县苹果枝干部轮纹病病斑，分离纯化后保存。

1.2 方法

1.2.1 粉红粘帚霉的菌落特征

在活化培养3～5d的粉红粘帚霉菌落边缘用5mm的无菌打孔器打取菌饼，转接到已制备好的9cm直径的PDA平板中央，重复3组实验，将接种好的PDA平板放置在28℃培养箱中培养，定时观察和记录粉红粘帚霉菌落颜色、边缘整齐程度、质地、气生菌丝梳密和发达程度、菌株产生色素的情况等变化。

1.2.2 粉红粘帚霉的形态特征

当纯化培养的粉红粘帚霉菌落颜色开始变为粉红色时，用无菌解剖针挑取菌落边缘菌丝置于载玻片上制成临时装片，在显微镜下观察粉红粘帚霉产孢结构，菌丝形态以及孢子形态特征。

1.2.3 粉红粘帚霉分子生物学鉴定

1.2.3 .1 液体培养与菌丝的获得

摇菌：在经过纯化的粉红粘帚霉菌落边缘用打孔器打取五个菌饼，将菌饼接种到PD（液体马铃薯）培养基中，28℃，200rpm恒温摇床上培养2d。

菌丝抽提：将培养好的菌丝用真空泵及布式漏斗抽提，除去培养液，获得干燥的粉红粘帚霉菌丝，然后用烘箱65℃烘干，-20℃保存备用。

1.2.3 .2 DNA的提取

采用CTAB法提取粉红粘帚霉DNA。

1.2.3 .3 PCR扩增

设置 25 μL 反应体系为 10×PCR buffer2.5μL，dNTP 1μL，ITS1 引 物 2μL，ITS4 引物 2μL，Taq 酶0.5 μL，Mg2+1μL，DNA 模板 2μL，ddH2O 14μL；其PCR扩增条件：94℃预变性 3min，94℃变性 1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 2min，重复步骤上述 30次，72℃延伸10 min。将获得PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中取5 μL电泳，观察目标片段的大小。

1.2.3 .4 CR产物的纯化回收和测序

扩增后的目标片段按试剂盒说明进行纯化回收，将回收的PCR产物送华大基因公司测序。

1.2.3 .5 分子鉴定与系统发育树的构建

将测定的菌株ITS序列提交到NCBI上，并用BLAST进行同源性序列比对，确定菌株的分类地位。在所测定的相关基因序列的基础上，再从Gen-Bank上搜集与测序菌株相关的序列，并首先对测定序列用Clustalx1.83进行序列对齐，删除缺失位点、残缺位点、非编码序列位点，然后利用MEGA 5.0软件进行系统发育分析，以自展法（bootstrap）进行检测，共循环1,000次，用邻接法构建菌株序列的邻接树。

2 结果与分析

2.1 粉红粘帚霉的菌落特征观察

在PDA培养基上，菌丝初为白色，边缘整齐，菌丝匍匐，较疏松，气生菌丝不发达，后菌丝变为粉红色，菌落表面有少许水溢出，菌落底有橙红色色素产生（见图 1）。

图1 粉红粘帚霉菌落形态Fig.1 Colonial morphology of Clonostachys

2.2 粉红粘帚霉的显微形态特征观察

分生孢子梗扫帚状分枝。分生孢子椭圆形，粘连在一起聚集成团状，菌丝无色，有隔膜，并且具有与其功能相适应的菌环（见图2）。

图2 粉红粘帚霉的形态特征Fig.2 Structure characterastics of Clonostachys rosea A粉红粘帚霉的产孢结构B分生孢子C菌丝D菌环结构

2.3 粉红粘帚霉菌株ITS序列测定

通过对菌株的rDNA ITS进行PCR扩增，其电泳结果见图3。对PCR扩增后的基因序列进行凝胶电泳，用2Kb Maker进行对照，我们发现所得序列大小约为600bp。

图3 部分菌株ITS序列电泳图Fig.3 The electrophorogram of ITS

2.4 粉红粘帚霉菌株系统发育树的构建

通过构建菌株的系统发育分析树我们可以发现，本次试验所用的菌株编号为JF817331.1，它的分类地位为半知菌门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘帚霉属，粉红粘帚霉。与已知编号为KP670432.1的粉红粘帚霉菌株具有最近的亲缘关系。在一定程度上我们可以通过系统发育分析树得 到供试菌株的分类地位并参照亲缘关系较近的已知菌株的特性推测供试菌株的形态特征等生物学特性。

图4 粉红粘帚霉菌株分子鉴定及系统发育分析树Fig.4Phylogenetic tree of Clonostachys rosea strain

3 结论与讨论

菌落形态显示，粉红粘帚霉菌丝初为白色，边缘整齐，菌丝匍匐，较疏松，气生菌丝不发达，后变为粉红色，菌落表面有少许水溢出，菌落底部有橙红色色素产生，通过对粉红粘帚霉的培养观察可以看到粉红粘帚霉可以产生大量分生孢子。ITS序列测定表明，该菌株与genbank中提交的粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）菌株同源性达到100%，上述研究明确了该菌株为半知菌门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘帚霉属，粉红粘帚霉。

[1］Domsch,K.H.Compendium of Soil Fungi[M］.London,Academic Press,1980.

[2］赵士振，粉红粘帚霉防治果蔬灰霉病的研究[D］.华中农业大学，2015.

[3］董佩佩，等.粉红粘帚霉67-1厚垣孢子形成与贮存研究.黑龙江农业科学，2013，（10）：48-50.

[4］杨荣华.粘帚霉GR菌株高产β-1,3-葡聚糖酶诱变、酶分离与性质研究及菌株鉴定[D］.扬州，扬州大学：2010，26.

[5］王春兰，郭顺星，等.粉红粘帚霉化学成分的研究[J］.微生物学通报,2001，28（4）：24-26.

[6］马桂珍，王淑芳，等.土壤因子对生防真菌粉红粘帚霉67-1消长动态的影响 [J］.中国生物防治学报，2013，29（1）：97-103.