李强 董伟杰 范俊 秦世炳 高孟秋



·论著·

38例骨关节结核患者病灶标本分枝杆菌培养及药物敏感性试验结果分析

李强 董伟杰 范俊 秦世炳 高孟秋

目的 对骨关节结核病灶脓液与肉芽组织分枝杆菌的培养阳性率及药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果进行分析。 方法 选择2008年10月至2009年10月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科住院并进行手术治疗的骨关节结核患者38例，术中同时采集病灶部位脓液及肉芽组织，采用改良罗氏培养基进行分枝杆菌培养，对培养阳性菌株进行12种抗结核药物(异烟肼、利福平、利福喷丁、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺)的药敏试验，并分析培养阳性率与患者病程、疗程的关系。 结果 38例患者肉芽组织培养阳性率为36.8%(14/38)，高于脓液培养(21.1%，8/38)，差异有统计学意义(Fisher确切概率法，P<0.001)；对14例患者肉芽组织培养阳性的菌株进行12种抗结核药物的药敏试验显示：全敏感4例，占28.6%(4/14)；单耐药3例，占21.4%(3/14)；多耐药5例，占35.7%(5/14)；耐多药1例，占7.1%(1/14)；广泛耐药1例，占7.1%(1/14)。病程<12个月与病程>12个月的患者，脓液分枝杆菌培养阳性率分别为26.9%(7/26)、8.3%(1/12)，差异无统计学意义(Fisher确切概率法，P=0.393)；肉芽组织分枝杆菌培养阳性率分别为46.2%(12/26)、16.7%(2/12)，差异无统计学意义(Fisher确切概率法，P=0.147)。术前化疗疗程<2个月的患者脓液分枝杆菌培养阳性率(38.9%，7/18)高于疗程>2个月的患者(5.0%，1/20)，差异有统计学意义(Fisher确切概率法，P=0.016)；术前化疗疗程<2个月的患者肉芽组织分枝杆菌培养阳性率(61.1%，11/18)高于疗程>2个月的患者(15.0%，3/20)，差异有统计学意义(Fisher确切概率法，P=0.006)。 结论 骨关节结核患者病灶标本分枝杆菌耐药率较高，术中应尽量采集肉芽组织进行分枝杆菌罗氏培养，以提高培养阳性率；术前化疗时间<2个月能提高分枝杆菌培养阳性率。

结核，骨关节； 分枝杆菌，结核； 培养基； 细菌学技术； 结果与过程评价(卫生保健)

骨关节结核是由结核分枝杆菌引起的感染性疾病，约占结核病患者的1%～3%[1]。多年来，骨关节结核主要依靠影像学诊断，依据术后病理确诊，作为结核病常用诊断手段的细菌学检查，在骨关节结核的诊断中却未得到临床医师重视。手术及抗结核药物应用是治疗骨关节结核的重要手段，且术后需继续进行抗结核药物治疗；在临床上，术后常继续沿用术前的治疗方案，但是对于抗结核药物治疗方案是否合理，值得临床医师进行探讨研究。本研究通过对38例骨关节结核患者的脓液及肉芽组织标本同时采用改良罗氏(Löwenstein-Jensen，L-J)培养基进行分枝杆菌培养，对培养阳性(培阳)菌株进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)、菌种鉴定，为术后抗结核药物治疗方案的选择提供依据；并分析分枝杆菌培养结果与患者的病程、术前化疗疗程的关系，以期为术后抗结核药物治疗时间的确定提供依据。

材料和方法

一、材料

1. 患者选择：选择2008年10月至2009年10月于首都医科大学附属北京胸科医院骨科住院经影像学及术后病理检查确诊的骨关节结核患者38例。其中，腰椎结核19例，胸椎结核10例，膝关节结核4例，肘关节结核3例，踝关节结核2例。纳入标准：影像学及术后病理证实为骨关节结核。排除标准：不符合纳入标准；妊娠、糖尿病、自身免疫性疾病、使用免疫抑制剂、HIV感染者。本研究经首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准。

2. 一般资料：男20例，女18例，中位年龄46(16～75)岁；病程<12个月者26例，>12个月者12例，病程中位数6个月(2～42个月)；患者术前均采用包含异烟肼(isoniazid，H)、利福平(rifampicin，R)的抗结核方案进行了治疗。其中，初治为正在采用标准化疗方案用药而未满疗程者[2]，共33例；复治为初治失败患者[2]，共5例。术前化疗疗程<2个月者18例，>2个月者20例，疗程中位数2个月(1～24个月)。

3. 抗结核药物：12种抗结核药物在改良L-J培养基内分为低、高两种浓度：H(美国Sigma公司)为1 μg/ml、10 μg/ml；R(美国Sigma公司)为50 μg/ml、250 μg/ml；利福喷丁(rifapentine，Rft，北京化学试剂厂)为5 μg/ml、50 μg/ml；乙胺丁醇(ethambutol，E，美国Sigma公司)为5 μg/ml、50 μg/ml；链霉素(streptomycin, Sm，中国Sigma公司)为10 μg/ml、100 μg/ml；卡那霉素(kanamycin，Km，美国Sigma公司)为10 μg/ml、100 μg/ml；阿米卡星(amikacin，Am，美国Sigma公司)为10 μg/ml、100 μg/ml；卷曲霉素(capreomycin，Cm，美国Sigma公司)为10 μg/ml、100 μg/ml；氧氟沙星(ofloxacin，Ofx，美国Sigma公司)为5 μg/ml、50 μg/ml；左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx，美国Fluka公司)为2 μg/ml、20 μg/ml；对氨基水杨酸(p-aminosalicylate，PAS，美国Sigma公司)为1 μg/ml、10 μg/ml；丙硫异烟胺(protionamide，Pto，中国Sigma公司)为25 μg/ml、100 μg/ml。药物均为纯品。

4. 培养基：采用改良L-J培养基，培养基配置参照《结核病诊断实验室检验规程》[3]。

二、方法

术中暴露结核病灶后，用无菌注射器抽取脓液2～3 ml，同时获取肉芽组织1 cm×1 cm×1 cm多块，立即置于无菌平皿并密封，避免紫外光及阳光照射，置于预先装有冰块的标本箱，保存于4 ℃冰箱，8 h 内进行处理。参照《结核病诊断实验室检验规程》[3]，脓液标本采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠法进行处理，进行抗酸杆菌涂片(采用萋-尼染色法)、离心后接种于改良L-J培养基。肉芽组织在加入适量磷酸盐缓冲液后，采用JJ-2B组织捣碎匀浆机(金坛市顺华仪器有限公司)制成标本混悬液，混悬液以3000×g离心30 min，弃上清液，沉淀中加入1倍量4%的氢氧化钠溶液，涡旋振荡2～3 min，室温放置30 min，放置期间，间歇振摇，使标本充分液化。然后再次离心，弃上清液，取沉淀物进行改良L-J培养。接种后的培养基置于37 ℃温箱培养，于接种后第3天、第7天分别观察结果一次，此后每周观察结果一次，至8周为止。培阳菌株采用绝对浓度法进行上述12种抗结核药物的药敏试验，同时采用对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)进行菌种鉴定。结果判读：PNB与TCH同时阴性，为牛分枝杆菌；PNB阴性，TCH阳性，为结核分枝杆菌；PNB与TCH同时阳性，为非结核分枝杆菌。并比较脓液与肉芽组织的细菌学结果，分析培养结果与患者病程、疗程的关系。

三、质控菌株

H37Rv作为质控菌株，由北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室提供。

四、统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料采用百分率表示；对脓液与肉芽组织培阳率的比较，以及脓液、肉芽组织分枝杆菌培养结果与病程、疗程的关系均采用Fisher确切概率法进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、脓液与肉芽组织分枝杆菌培养结果的比较

脓液的细菌学结果：涂片阳性(涂阳)培阳、涂片阴性(涂阴)培阳、涂阳培养阴性(培阴)各4例，均占10.5%(4/38)，涂阴培阴26例，占68.4%(26/38)。肉芽组织改良L-J培养结果：14例培阳，占36.8%(14/38)，24例培阴，占63.2%(24/38)。脓液与肉芽组织培养情况比较，脓液培阳者，肉芽组织均培阳，肉芽组织培阳率为36.8%(14/38)，高于脓液培阳率[21.1%(8/38)]，采用Fisher确切概率法进行检验，差异有统计学意义(P<0.001)。具体见表1。

表1 38例患者肉芽组织与脓液分枝杆菌培养情况

14例肉芽组织培阳菌株进行12种抗结核药物的药敏试验：全敏感4例，占28.6%(4/14)；单耐药3例，占21.4%(3/14)，其中，耐H 1例，耐R 1例，耐Sm 1例；多耐药5例，占35.7%(5/14)，其中，同时耐H、E 1例，同时耐H、E、Sm 1例，同时耐E、Sm、Km、PAS 1例，同时耐R、Ofx、Lfx、Km 1例，同时耐H、E、Ofx、Lfx 1例。耐多药结核病(MDR-TB)1例，占7.1%(1/14)，同时对H、R、E、Sm、Km耐药。广泛耐药结核病(XDR-TB)1例，占7.1%(1/14)，同时对H、R、E、Sm、Km、Ofx、Lfx耐药。全敏感、单耐药及2例多耐药患者(耐H、E及耐H、E、Sm)均为初治患者；而3例多耐药患者(耐E、Sm、Km、PAS，耐R、Ofx、Lfx、Km，耐H、E、Ofx、Lfx)、MDR-TB患者及XDR-TB患者均为复治患者。对14例培阳标本进行分枝杆菌菌种鉴定，均为结核分枝杆菌。

二、脓液分枝杆菌培养与病程的关系

病程<12个月与病程>12个月的患者，脓液分枝杆菌培阳率分别为26.9%(7/26)、8.3%(1/12)，采用Fisher确切概率法进行比较，差异无统计学意义(P=0.393)。具体见表2。

表2 38例患者病程与脓液分枝杆菌培养的关系

三、脓液分枝杆菌培养与术前化疗疗程的关系

术前化疗疗程<2个月的患者脓液分枝杆菌培阳率为38.9%(7/18)，高于疗程>2个月的患者[5.0%(1/20)]，采用Fisher确切概率法进行比较，差异有统计学意义(P=0.016)。具体见表3。

表3 38例患者疗程与脓液分枝杆菌培养的关系

四、肉芽组织分枝杆菌培养与病程的关系

病程<12个月与病程>12个月的患者，肉芽组织分枝杆菌培阳率分别为46.2%(12/26)、16.7%(2/12)，采用Fisher确切概率法进行比较，差异无统计学意义(P=0.147)。具体见表4。

表4 38例患者病程与肉芽组织分枝杆菌培养的关系

五、肉芽组织分枝杆菌培养与术前化疗疗程的关系

术前化疗疗程<2个月的患者肉芽组织分枝杆菌培阳率为61.1%(11/18)，高于疗程>2个月的患者[15.0%(3/20)]，采用Fisher确切概率法进行比较，差异有统计学意义(P=0.006)。具体见表5。

表5 38例患者疗程与肉芽组织分枝杆菌培养的关系

讨 论

骨关节结核的诊断手段主要包括影像学、病理学及微生物学检查。目前，获得骨关节结核标本最常用的方法是病灶部位穿刺采集脓液，但长期以来脓液结核分枝杆菌培阳率低[4]。骨与关节结核最好发的部位是脊柱，但由于脊柱结核解剖位置深，周围毗邻重要脏器，须行CT引导下穿刺活检，但穿刺技术难度大，限制了脊柱结核的早期发现，而且往往获得的组织量微小[5]；所以，术中采集其他标本进行结核分枝杆菌培养有一定必要性。早期诊断和及时治疗骨关节结核非常重要，以防止永久性神经系统损伤，并尽量减少脊柱畸形[6-8]。抗结核药物治疗、手术清除病灶是治疗骨关节结核的基本方法。骨关节结核术后需继续进行抗结核药物治疗，长期以来，术后抗结核药物的选择及治疗时间的长短一般由临床医师根据经验决定，但如果能对结核分枝杆菌培阳菌株进行药敏试验，根据药敏试验结果选择抗结核药物将可以提高疗效，缩短治疗时间，避免耐药性的产生；将结核分枝杆菌培养结果结合患者病程、疗程进行综合分析，可以为术后抗结核药物治疗时间的确定提供一定依据。故笔者对此进行了初步研究。

本研究手术中同时采集了患者的脓液及肉芽组织标本。对脓液进行分枝杆菌涂片及培养，涂阳8例(21.1%)，培阳8例(21.1%)，而肉芽组织分枝杆菌培阳14例(36.8%)，采用Fisher确切概率法进行统计学分析，差异有统计学意义(P<0.001)，认为骨关节结核肉芽组织比脓液标本中分枝杆菌培阳率高。董伟杰等[9]进行的研究显示，脓液分枝杆菌L-J培阳率为20.0%，肉芽组织培阳率为20.8%，本研究中脓液培阳率与之相似，肉芽组织培阳率更高，考虑可能与本研究中对肉芽组织匀浆后进行离心富集细菌而提高了培阳率，以及本研究样本量相对较少有关。

虽然手术治疗在骨关节结核治疗中发挥着举足轻重的作用，但抗结核药物治疗始终是骨关节结核最基本的治疗手段和中心环节[10]。术前需进行药物治疗以稳定病灶，防止术中结核分枝杆菌播散。而手术的作用主要在于病灶清除、椎管减压及脊柱稳定性重建[11]。术后仍需继续进行药物治疗，以消灭体内残余的结核分枝杆菌。临床上术后药物治疗常沿用术前的方案。本研究患者中培阳菌株药敏试验显示全敏感4例，占28.6%(4/14)，单耐药3例，占21.4%(3/14)，多耐药5例，占35.7%(5/14)，MDR-TB及XDR-TB各1例，各占7.1%(1/14)。说明骨关节结核病灶中结核分枝杆菌对抗结核药物耐药的比例仍不低。虽然在联合抗结核治疗的基础上，尽快手术治疗，彻底清除病灶，是治疗耐药骨关节结核最有效的方法[12]，但耐药骨关节结核尚无统一固定的化疗方案。故在临床工作中，提高结核分枝杆菌培阳率，早期获得患者耐药及药敏试验结果，给予合理的抗结核药物并联合手术治疗是治愈骨关节结核的关键[13]。骨关节结核的病原菌以结核分枝杆菌为主，极少数为牛分枝杆菌[14]。本研究14例培阳标本进行分枝杆菌菌种鉴定，均为结核分枝杆菌。

绝大多数骨关节结核为继发性结核病，原发病灶部位一般在肺部或消化道[5]。在原发病灶处于活动期时，结核分枝杆菌经血液循环到达骨与关节部位，不一定会立即发病，而是潜伏其中[5]。当机体因糖尿病、自身免疫性疾病、使用免疫抑制剂等导致免疫力下降时，这些潜伏的结核分枝杆菌则会活跃起来而出现临床症状，在这些时候，患者才可能到医院诊断、治疗。那么，患者病程长短及术前化疗疗程长短是否影响结核分枝杆菌的培阳率？从本研究中看，对病程在12个月以内与12个月以上的患者进行比较，脓液分枝杆菌培阳率分别为26.9%、8.3%(P=0.393)；肉芽组织分枝杆菌培阳率分别为46.2%、16.7%(P=0.147)，不同病程的骨关节结核患者脓液、肉芽组织标本分枝杆菌培阳率差异无统计学意义。术前化疗疗程在2个月以内与2个月以上比较，脓液分枝杆菌培阳率分别为38.9%、5.0%(P=0.016)；肉芽组织分枝杆菌培阳率分别为61.1%、15.0%(P=0.006)，疗程在2个月以内较疗程2个月以上的骨关节结核患者脓液、肉芽组织分枝杆菌培阳率高。葛建忠等[15]研究表明，化疗2个月以内较化疗2个月以上所采集的脓液标本培阳率高，与本研究结果一致。而关于骨关节结核标本分枝杆菌培养结果与病程的关系尚未见其他文献报道。那么，术后抗结核药物治疗到底需要多长时间？骨关节结核化疗方案按疗程长短分为标准化疗、短程化疗及超短程化疗等，但关于其疗程长短尚没有统一的界定。Wang等[16]报道了76例脊柱结核，术后应用超短程化疗(2H-R-Z-S/2.5H2-R2-Z2)、短程化疗(3H-R-Z-S/5H2-R2-Z2)均取得了与标准化疗(3H-R-Z-S/9H2-R2-Z2)同样满意的效果。目前，短程化疗相对统一的共识是不低于6个月[17]。故术后抗结核药物治疗时间不能进行“一刀切”，需实施个体化治疗。根据本研究结果，术前化疗2个月以内者，分枝杆菌培阳率高，细菌处于活跃生长状态，术后需延长治疗时间；术前化疗2个月以上者，分枝杆菌部分被杀灭，术后根据病情可适当缩短化疗时间。

本研究由于样本量少，以及标本仅有脓液、肉芽组织，所获结果可能存在偏差。有待增加样本量，以及扩大术中标本种类的采集进行进一步研究，以更好地指导骨关节结核的药物治疗，提高骨关节结核治愈率。

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(本文编辑：郭萌)

Analysis of mycobacterial culture and drug sensitivity test in 38 patients with osteoarticular tuberculosis

LIQiang,DONGWei-jie,FANJun,QINShi-bing,GAOMeng-qiu.

DepartmentofTuberculosis,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

Correspondingauthor:GAOMeng-qiu,Email:liqliq2008@126.com

Objective To analyze culture and drug susceptibility testing (DST) of Mycobacterial isolates from pus and granulation tissue in patients with osteoarticular tuberculosis. Methods Thirty-eight cases with osteoarticular tuberculosis admitted in our hospital were enrolled and collected clinical specimens including pus and granulation tissue from focus during Oct. 2008 to Oct. 2009. All specimens were inoculated to Löwenstein-Jensen (L-J) medium and DST covered twelve drugs including isoniazid, rifampicin，rifapentine，ethambutol, streptomycin, kanamycin，amikacin，capreomycin，ofloxacin，levofloxacin，p-aminosalicylate and protionamide was performed further in culture positive specimens. The relationship between the culture positive rate and the course of disease and treatment was analyzed. Results The culture positive rate of granulation tissues (36.8%, 14/38) was higher than that of pus (21.1%, 8/38) with significant difference (P<0.001). DST in 14 granulation tissues specimens with culture positive showed that full sensitivity was in four cases (28.6%), mono-drug resistant tuberculosis in three cases (21.4%), poly-drug resistance in five cases (35.7%), multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) in one case (7.1%) and extensive drug resistance in one cases (7.1%), respectively. The culture positive rate of pus from patients with disease course more than 12 months (26.9%, 7/26) was higher than that of patients with disease course less than 12 months (8.3%, 1/12) without significant difference (P=0.393). The similar result was found in the granulation tissues (46.2% (12/26) vs. 16.7% (2/12),P=0.147). However, there were significant difference about the culture positive rate of pus between patients with treatment course less than 2 months and more than 2 months (38.9% (7/18) vs. 5.0% (1/20),P=0.016). The similar result was found in granulation tissues (61.1% (11/18) vs. 15.0% (3/20),P=0.006). Conclusion The rate of drug resistance is very high in focus of granulation tissues from patients with osteoarticular tuberculosis. Granulation tissues should be collected to culture forMycobacterialduring the operation especially for patients with treatment course less than 2 months.

Tuberculosis, osteoarticular;Mycobacterialtuberculosis; Culture media; Bacteriological techniques; Outcome and process assessment (health care)

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.015

北京市医院管理局“登峰”计划专项经费资助项目(DFL20151501)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院结核科(李强、高孟秋)，骨科 北京骨关节结核诊疗中心(董伟杰、范俊、秦世炳)

高孟秋，Email：liqliq2008@126.com

2016-08-17)