傅增辉， 孙洪英， 刘 松， 贺淑慧

血清成纤维细胞生长因子23、Klotho蛋白水平与急性脑梗死患者颈动脉粥样硬化和脑卒中危险因素的相关性

傅增辉1,2， 孙洪英1， 刘 松1,2， 贺淑慧1,2

目的 探讨血清成纤维细胞生长因子23(FGF23)、Klotho蛋白水平与急性脑梗死患者颈动脉粥样硬化和脑卒中危险因素的相关性。 方法 入选166例急性脑梗死患者作为研究组，随机匹配152例健康为对照组，对血脂、同型半胱氨酸、C反应蛋白等指标进行采集，采用ELISA法测定各组血清中FGF23和Klotho蛋白水平，颈动脉As用多普勒超声仪检测，并与正常对照组进行比较。应用多因素Logistic回归对血清中FGF23水平与其他观察指标的相关性及影响因素进行分析。 结果 研究组tHcy、hs-CRP、FGF23水平显著高于对照组(P<0.05)，而HDL-C、Klotho蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)，TC、LDL-C、TG与对照组相比统计学差异不显著(P>0.05)。研究组的颈动脉As的比率、斑块数、斑块评分及IMT显著高于正常对照组(P<0.05)。以颈动脉As情况为因变量，进行多因素非条件Logistic回归分析显示，hs-CRP、tHcy、FGF23为颈动脉As的危险因素，而HDL-C、Klotho蛋白为颈动脉As的保护因素。相关性分析显示，血FGF23水平与hs-CRP、tHcy、及颈动脉As斑块评分、IMT呈正相关(均P<0.05)；而与Klotho蛋白、HDL-C呈负相关(均P< 0.05)。结论 FGF23为动脉粥样硬化及脑梗死发生的危险因素，而Klotho蛋白则为动脉粥样硬化及脑梗死发生的保护因素，二者呈负相关。

成纤维细胞生长因子23； Klotho蛋白； 急性脑梗死； 动脉粥样硬化

Klotho基因Kuro-o于1997年发现的基因，最初发现其与原发性高血压及人类衰老密切相关，并且小鼠体内的该基因突变可引起寿命缩短及一系列类似人类衰老的表现，如动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)、骨质疏松、皮肤萎缩等。近来关于Klotho与成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)相互作用研究较多，FGF23是多肤激素成纤维细胞生长因子家族的成员，是体内血磷和1,25-二羟活性维生素D3的调节因子。研究发现，FGF23生物效应的有效发挥与Klotho蛋白关系密切相关，FGF23激活FGFR后可诱发血管内膜增生及纤维化，加重As[1]。As作为脑血管病发生的直接原因，推测血清Klotho蛋白、FGF23水平的变化可能与脑梗死的发生及发展相关。为此，本研究对急性脑梗死患者的血清Klotho蛋白、FGF23水平和颈动脉As情况进行检测，旨在探讨急性脑梗死患者血清Klotho蛋白、FGF23水平的改变及与颈动脉As和脑卒中危险因素的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 (1)研究组：选择2015年1月-2016年11月在我院住院的急性脑梗死患者166例，病程3.0 h～3 d，平均(10.60±8.71)h，均符合全国第四届脑血管病学术会议制定的各类脑血管病诊断标准，并经头部CT或MRI证实；(2)正常对照组：随机选取同期在我院健康体检者并经头部CT或MRI排除脑梗死共152例。血脂异常诊断符合《中国成人血脂异常防治指南(2016)》；高血压诊断参考《中国高血压防治指南(2010)》；2型糖尿病诊断符合《中国2型糖尿病防治指南(2013年版)》。本研究方案通过本院医学伦理委员会审查，所有入选患者均签署知情同意书。排除标准为大面积脑梗死或昏迷；有严重的心、肝、肾功能障碍及精神病；有近期(3 m内)手术史；妊娠或哺乳期妇女。

1.2 方法

1.2.1 血生化指标和一般情况采集 研究组患者于入院次日清晨、对照组健康人于体检日清晨测量身高、体质量、血压，并计算BMI，抽取空腹静脉血。使用罗氏COBAS INTEGRA 800全自动生化分析仪测定化分析仪检测血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三脂(TG)水平；用速率散射比浊法测定血清超敏C-反应蛋白(hs-CRP)；采用循环酶法测定血清tHcy水平，试剂盒由德赛诊断系统(上海)有限公司提供。分别应用人Klotho蛋白ELISA检测试剂盒(购自美国R&D公司)和FGF23蛋白ELISA检测试剂盒(购自美国R&D公司)，使用Bio-Rad 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司生产)，严格按ELISA试剂盒说明书流程操作。

1.2.2 颈动脉超声检查 采用飞利浦IU22彩色多普勒超声诊断仪，选择3.0～9.0 MHz线阵及2.0～5.0 MHz凸阵探头。沿颈动脉走行自下而上连续扫描双侧颈总动脉(CCA),颈动脉分叉、颈内动脉(ICA)颅外段及椎动脉。颈动脉内-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)评估:分别检测CCA远段(颈动脉分叉水平下方1.0～1.5 cm)、颈动脉球部和ICA近段(颈动脉分叉水平上方1.0～1.5 cm)3个部位。根据颈动脉斑块回声强度、均质性、斑块表面规则度和斑块内结构特点，将斑块分为易损斑块和非易损斑块，同时具有两类斑块以严重的易损斑块为分类依据。

2 结 果

2.1 基本资料及生化指标、FGF23、Klotho蛋白的比较 研究共纳入318例患者，研究组166例，对照组152例。研究组与对照组一般资料进行比较，男性、年龄、BMI、吸烟史、高血病史、糖尿病史差异均无统计学意义(均P>0.05)(见表1)。研究组tHcy、hs-CRP、FGF23水平高于对照组显著(P<0.01、P<0.001、P<0.001)，而HDL-C、Klotho蛋白水平低于对照组显著(P<0.05、P<0.001)，TC、LDL-C、TG与对照组相比统计学差异不显著(均P>0.05)(见表2)。

2.2 两组颈动脉超声检查结果比较 研究组的颈动脉As的比率、斑块数、斑块评分及IMT显著高于正常对照组(P<0.05～0.001)(见表3)。

2.3 FGF23、Klotho蛋白水平与颈动脉As形成的关系 以颈动脉As情况为因变量，FGF23、Klotho蛋白水平及其他指标为自变量，进行多因素非条件Logistic回归分析显示，hs-CRP、tHcy、FGF23为颈动脉As的危险因素，而HDL-C、Klotho蛋白为颈动脉As的保护因素(见表4)。

2.4 血FGF23、Klotho蛋白水平、其他指标的相关性 将所有对象的血FGF23、Klotho蛋白水平、其他指标行相关性分析显示，血FGF23水平与hs-CRP、tHcy、及颈动脉As斑块评分、IMT呈正相关(r=0.124～0.278，均P<0.05)；而与Klotho蛋白、HDL-C呈负相关(r=-0.217～0.379，均P<0.05)。

表1 两组一般资料的比较

表2 两组生化指标及FGF23、Klotho蛋白水平的比较

注：TC:总胆固醇；HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇；TG甘油三脂；tHcy:同型半胱氨酸；hs-CRP:高敏C-反应蛋白；FGF23:蛋白；Klotho:蛋白。与对照组相比*P<0.05,#P<0.01,##P<0.001

表3 两组颈动脉超声检查结果的比较

与对照组相比*P<0.05,#P<0.001

表4 颈动脉粥硬化形成的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

As是一种严重危害人类健康的常见病，是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础。到目前为止，As的发病机制尚未完全清楚，目前关于As发病机制的存在多种学说，主要有脂质浸润学说、血小板功能亢进学说、氧化应激学说、血栓形成学说、炎症学说等[2]，涉及多种病理生理学机制，以至临床缺乏有效的防治药物。大量的基础和临床研究表明，致As的危险因素包括高脂血症、高血压、糖尿病、高纤维蛋白原血症、肥胖、吸烟、肾素-血管紧张素-醛固酮系统活化[3]。本研究再次证实高tHcy血症及低HDL-C水平为As及缺血性脑血管病发生的危险因素。

研究发现，颈动脉As是引起缺血性脑血管病的重要因素，对于严重颈动脉As患者，即使通过早期的药物干预，其脑梗死的发生率仍在20%左右，表明颈动脉As在脑梗死的发病过程中起了十分重要的作用[4]。颈动脉超声是应用最广泛的颈动脉As的评价方法，除可判断颈动脉狭窄的程度外，还可对颈动脉IMT、斑块内部成分、表面形态结构以及血流动力学变化进行检查和评价[5]。超声在颈动脉壁形态学观察方面较DSA和MRA敏感，并且可以对斑块的性质做出判断。颈动脉超声不仅可以了解颈动脉IMT及斑块的性质及大小，而且可以将其作为观察患者全身As的一个“窗口”，预测可能发生的脑血管病事件，从而提早作出干预。

Klotho基因是由Matsumura等发现的一种新型基因，位于13q12染色体，长约5万个碱基对，由5个外显子和4个内含子组成[6]。Klotho蛋白是Klotho基因的表达产物，国内李宝善等证实在大鼠心脏、主动脉、脑等组织中均有Klotho mRNA和蛋白表达[7]。目前的研究表明，Klotho蛋白可与体内多种血管活性物质相互作用，具有保护血管内皮、舒张血管、促进血管新生、抗As作用。并且动物实验表明，Klotho蛋白的低表达可导致血管内皮细胞功能发生紊乱，加速As形成；而体外实验证实Klotho蛋白可以显著减轻H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡和衰老，并能促进内皮源性NO合成[8]。

FGF23作为成纤维细胞生长因子家族的最新成员，是一种来源于骨细胞和成骨细胞的激素样物质，其经典作用为调节机体磷酸盐和维生素D平衡，FGF23是成纤维细胞生长因子家族中FGF19亚组成员，在脑、心脏等组织中均有表达。与其他的FGF家族成员不同，FGF23不是膜蛋白，而是一种分泌蛋白，存在血液循环中，具有激素功能，而目前研究发现其同时与诱导炎性反应，引起细胞增殖迁移有重要联系。

体外研究证实FGF23与FGFR结合并激活受体，在体内则需要Klotho蛋白作为辅助受体，说明Klotho蛋白是FGF23信号转导通路的关键因子，FGF23需通过Klotho蛋白的介导发挥生物学作用。以往研究认为FGF23/klotho轴主要在慢性肾脏病矿物质与骨代谢起作用，但近年来大量研究证实在心血管疾病中也起到关键作用[9]。由于许多组织均表达FGFR，所以Klotho蛋白的存在决定了FGF23的耙器官。近期国外学者已经证实在Klotho蛋白及FGFR1、 FGFR3在人胸主动脉标本中有表达，并且在急性冠脉综合征的患者的血栓中证实了有Klotho的表达，这提示了人类的血管组织可能是FGF23的耙器官。此外Klotho蛋白在冠脉闭塞的血栓中有表达提示了，FGF23/Klotho轴在人类血管病理生理学以及心血管病的假定的作用[10]。

本研究显示研究组的血Klotho蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)，而FGF23明显高于正常对照组(P<0.05)；血FGF23水平与FBG、LDL、颈动脉IMT、粥样硬化斑块评分呈正相关(P<0.05)，与Klotho蛋白呈负相关(P<0.05)。推测FGF23为As及脑梗死发生的危险因素，而Klotho蛋白则为As及脑梗死发生的保护因素。Panwar及Dalal等[11,12]均证实缺血性脑血管病与FGF23的相关性，与本研究结果相同，但缺血性脑血管病与Klotho蛋白的研究罕有报道。在本研究中FGF23与Klotho蛋白呈显著负相关性，那么在缺血性脑血管病的发生发展中是否存在FGF23/Klotho轴的作用，尚需进一步进行分子生物学的实验。同时hs-CRP、tHcy及HDL-C均表现与FGF23、Klotho蛋白的相关性，是否存在一定的协同作用尚需进一步进行分子生物学实验。通过进一步的实验，FGF23与Klotho蛋白有可能为缺血性脑血管病防治和预后判断的重要标志物。

[1]Shah NH,Dong C,Elkind MS,et al.Fibroblast growth factor 23 is associated with carotid plaque presence and area:the northern manhattan study[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2015,35(9):2048-2053.

[2]Hansspn UK.Inflammation,atherosclerosis,and coronary artery disease[J].N Engl J Med,2005,353(4):429.

[3]周官恩,安中平,王景华,等.缺血性脑卒中分型、危险因素和预后的性别差异研究[J].中风与神经疾病杂志,2014,31(7):625-627.

[4]Nonin S,Iwata S,Sugioka K,et al.Plaque surface irregularity and calcification length within carotid plaque predict secondary events in patients with coronary artery disease[J].Atherosclerosis,2016,25(9):29-34.

[5]周 君,孙志宏,张 钰,等.经颅多普勒和颈动脉超声检测高血压患者无症状性颅内外动脉粥样硬化病变[J].中风与神经疾病杂志,2014,31(4):345-347.

[6]李宝善.Klotho真核表达载体的构建及其干预自发性高血压大鼠高血压进程与心脏损害的作用机制研究[D].重庆医科大学,2012.

[7]Abousaab A,Warsi J,Salker MS,et al.β-Klotho as a negative regulator of the peptide transporters PEPT1 and PEPT2[J].Cell Physiol Biochem,2016,40(5):874-882.

[8]Francis C,David V.Inflammation regulates fibroblast growth factor 23 production[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2016,25(4):325-332.

[9]Urakawa I,Yamazaki Y,Shimade T,et al.Klotho convers canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23[J].Nature,2006,444(12):770-774.

[10]Javier Donate.Expression of FGF23/Klotho system in vascular tissue[J].International Journal of cardiology,2013,165(1):179-183.

[11]Panwar B,Jenny NS,Howard VJ,et al.Fibroblast growth factor 23 and risk of incident stroke in community-living adults[J].Stroke,2015,46(2):322-328.

[12]Dalal M,Sun K,Cappola AR,et al.Relationship of serum fibroblast growth factor 23 with cardiovascular disease in older community-dwelling women[J].Eur J Endocrinol,2011,165(5):797-803.

The correlation among serum FGF23 and klotho protein level,acute cerebral infarction carotid atherosclerosis,and risk factors for stroke

FUZenghui,SUNHongying,LIUSong,etal.

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014010,China)

Objective Discuss the correlation among serum fibroblast growth factor 23 (FGF23),Klotho protein level,acute cerebral infarction patients’ carotid atherosclerosis,and risk factors for brain stroke.Methods select 166 acute cerebral infarction patients as research group,randomly match 152 healthy people as control group,collect the indicators such as blood fat,measure FGF 23 and Klotho protein level in serum of each group,with ELISA method,detect carotid artery As with doppler ultrasound instrument,and compare it with the normal control group.Analyze the FGF23 level in serum,and the correlation and influence factors of other obvervational indicators with multi-factor logistic regression.Results The tHcy,hs-CRP,and FGF23 levels of research group were higher than that of control group (P<0.05) significantly,while HDL-C and Klotho protein were lower than that of control group (P<0.05) significantly,and the statistic difference between TC,LDL-C,and TG and that of control group (P>0.05) was insignificant.Ratio,number of patches,patch score,and IMT of carotid artery As of research group were higher than that of the normal control group (P<0.05) significantly.Taking carotid artery As as the dependent variable,multi-factor non-conditional logistic regression was implement,and the results showed that hs-CRP,tHcy,and FGF23 were the risk factors for carotid artery As,while HDL-C and Klotho protein were the protective factors of carotid artery As.The correlation analysis showed that there was positive correlation among FGF 23 level,hs-CRP,tHcy,carotid artery As,patch score,and IMT (allP<0.05);but it presented negative correlation with HDL-C and Klotho protein (allP<0.05).Conclusion FGF 23 is the risk factor for the emergence of atherosclerosis and cerebral infarction,while Klotho protein is the protective factor of atherosclerosis and cerebral infarction,and they present the negative correlation.

Fibroblast growth factor23; Klotho protein; Acute cerebral infarction; Atherosclerosis

1003-2754(2017)04-0316-04

2016-12-13；

2017-03-30

(1.包头医学院第一附属医院神经内科，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院研究生学院，内蒙古 包头 014010)

孙洪英，E-mail：sunhongying2004@sina.com

R743.3

A