孙家兰， 杨 康， 黄 澍， 胡荣郭， 傅 毅， 李龙宣

染色体9p21.3多态性与颈动脉斑块和神经功能缺损的相关性探讨

孙家兰1， 杨 康2， 黄 澍1， 胡荣郭1， 傅 毅2， 李龙宣1

目的 探讨中国汉族人群急性脑梗死患者染色体9p21.3基因多态性与颈动脉斑块、神经功能缺损的相关性。方法 采用回顾性病例对照研究，556例急性缺血性卒中病例(无斑块为对照组231例、单斑块组67例、多斑块组258例)，根据美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)进行评分，颈动脉超声检测颈动脉斑块。用SPSS 19.0软件统计数据。结果 斑块组的平均住院天数明显多于无斑块组(P<0.05)。颈动脉斑块与入院时的NIHSS评分之间呈正相关(P<0.05)。无论是在小于等于65岁还是超过65岁两个年龄段，9p21区带上所有6个SNPs(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)的等位基因频率分布在无斑块组(对照组)与斑块组均无显著性意义(P>0.05)。同时发现颈动脉斑块的存在导致严重神经功能缺损(P<0.001；OR=2.29；95%CI=1.54～3.40)。单斑组、多斑组患者对神经功能缺损的影响分别为无斑块组的1.87倍(95%CI，1.02～3.42；P=0.043)和2.42倍(95%CI，1.59-3.66；P<0.001)，而颈动脉斑块的面积大小与神经功能缺损无明显相关性。结论 6个9p21.3区域SNP位点与颈动脉粥样硬化之间无关联性；急性脑梗死发病期有颈动脉斑块的患者有更严重的神经功能缺损。

急性脑梗死； 9p21.3多态性； 颈动脉斑块； 神经功能缺损

脑梗死(cerebral infarction，CI)是指各种原因引起的脑部血液供应障碍，包括动脉粥样硬化性脑血栓形成、脑栓塞、腔隙性脑梗死等。越来越多的研究显示脑梗死的发生可能与特定的基因多态性有关[1]。有研究发现9p21.3号染色体上单核苷酸多态性(SNPs)也是脑梗死的危险因素[2]，是颈动脉斑块形态的相关因素[3]，包括出现有无斑块、斑块面积和体积。动脉粥样硬化斑块的形成会增加卒中风险[4]。因此，我们采用病例对照研究方法研究了上海市四家医院9p21.3基因相关的单核苷酸多态性与颈动脉斑块的相关性，且探讨动脉粥样硬化斑块与入院时神经功能缺损之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料 我们回顾性地共纳入从2012年10月-2015年12月来自上海四家医院(上海市浦东新区公利医院、上海交通大学医学院附属瑞金医院、复旦大学附属闵行医院、上海中医药大学附属岳阳医院)556例首次急性脑梗死患者(见表1)，根据中国急性脑梗死指南2010[4]。所有卒中患者经头部计算机断层扫描(CT)/磁共振成像(MRI)。急性期脑梗死的定义如下：(1)急性局灶性或整体性神经功能缺损的发生持续24 h或更长时间，CT或MRI有脑缺血损害的证据；(2)CT或MRI扫描无颅内出血。除外原发性脑肿瘤、脑转移、硬膜下血肿、癫痫发作后瘫痪、脑外伤或全身性疾病(感染、肝脏或肾脏疾病)。高血压被定义为使用降压药物或基线血压≥140/90 mmHg。糖尿病被定义为空腹血糖≥7.0 mmol/L或使用降糖药物。颈动脉斑块定义为颈动脉内膜中层厚度(IMT)≥1.5 mm，进行颈动脉彩色多普勒超声检查在普通/颈内动脉和椎动脉的最大斑块面积(mm2)是由所有颈动脉斑块的最大轴线长度相乘估计[5]。我们还进行了分层分析，将556例脑梗死患者根据超声检测到的颈动脉斑块的数量分成：无斑块组、单斑块组或多个斑块组。在556例患者中，无斑块组231例(41.5%)，单斑块组67例(12.1%)，多斑块组258例(46.4%)。无斑块组男性占62.8%、单斑块组男性占65.7%、多斑块组男性占65.1%。同时根据国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分，结果分为轻度(NIHSS≤3)和中重度(NIHSS≥4)[6,7]。所有患者均按照急性脑梗死治疗指南接受治疗。根据世界卫生组织的年龄分级标准，我们将所有脑梗死患者分为两组：年轻组(≤65岁)和老年组(>65岁)。经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验结果显示，本研究群体在各基因位点上的分布频率均符合遗传平衡，具有群体代表性，且经LDR均检测出野生型、纯合和杂合变异型3种基因型。

1.2 方法 所有被检者禁食12 h，晨起空腹抽取静脉血5 ml，在EDTA抗凝管中混匀，其中，2 ml用作DNA提取；另3 ml静脉血分离作血清血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)测定，并记录血压和相关临床资料。采用酚氯仿法提取全血基因组DNA，通过引物设计软件Primer Express、Oligo进行引物构建(见表1)，再经PCR-LDR检测并进行基因SNPs分型。多重PCR扩增：PCR反应总体积为20 μl。扩增步骤：95 ℃预变性120 s，然后按94 ℃ 30 s、50 ℃ 90 s、65 ℃ 60 s共35循环，最后65 ℃延长至10 min；循环结束后，取2 μl反应产物在3.0%琼脂糖凝胶电泳检测反应。多重LDR反应：LDR反应总体积为10 μl。反应循环参数：95 ℃预变性120 s，然后按94 ℃ 15 s、50 ℃ 25 s共40循环。后各取1 μl LDR连接产物与1 μl ABI GS-500 ROX荧光标记分子量标准和1 μl去离子甲酰胺上样液混合，95 ℃加热变性2 min，置于冰水混合物上急速冷却。LDR产物测序电泳并分析：使用PRISM 3730型DNA测序仪，于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中进行3000V毛细管电泳2.5 h；采用GENESCANTM672软件、Genemapper软件进行数据收集并进行SNPs位点的基因分型。PCR产物核苷酸序列测定：随机选取上述染色体9p21.3片段6个位点的野生型、纯合和杂合变异型PCR产物各2例，由上海翼和应用生物技术有限公司直接测序验证。

1.3 统计学方法 统计数据用SPSS统计软件(Vrsion 18.0)进行统计，先行单因素分析筛查可能的危险因素变量再引入多因素分析。计量资料的比较采用正态分布性检验及方差齐性检验，对于正态分布资料，使用t检验；对于偏态分布资料，使用Mann-WhitneyU法检验。计数资料采用χ2检验，计算等位基因和基因型频率。再通过多元Logistic回归模型，分析校正年龄、性别、高血压等暴露因素后的比值比(odds ratio，OR)及95%置信区间(confidence interval,CI)，对有统计学差异的位点建立遗传模型分析易感性并探讨基因交互作用。统计效能，α双侧=0.05。

2 结 果

2.1 有斑块组患者空腹血糖和收缩压数据值较高 有统计学差异(P<0.05)。但是3组之间的高血压和血脂数据无显著差异性(P>0.05)。入院时，斑块组比无斑块组有较高的NIHSS评分，有统计学差异(4.75±5.14 vs 3.10±4.37，P<0.05)，但单个和多个斑块组之间的NIHSS评分(4.78±5.28 vs 4.74±5.12)无显著差异。斑块组的平均住院天数明显多于无斑块组(P<0.05)。颈动脉斑块与入院时的NIHSS评分之间的呈正相关(P<0.05)(见表2)。

2.2 无论是在小于等于65岁还是超过65岁两个年龄段，9p21区带上所有6个SNPs(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)的等位基因频率分布在无斑块组(对照组)与斑块组均无显著性意义(P>0.05)(见表3)。

2.3 为了排除多种危险因素和卒中亚型的影响 我们采用Logistic回归方法研究斑块对入院时神经功能缺损的影响，发现颈动脉斑块的存在导致严重神经功能缺损(P<0.001；OR=2.29；95%CI=1.54～3.40)。单斑组、多斑组患者对神经功能缺损的影响分别为无斑块组的1.87倍(95%CI，1.02～3.42；P=0.043)和2.42倍(95%CI，1.59～3.66；P<0.001)(见表4)。

表1 6个位点的基因库序列号、引物序列和PCR长度

表2 脑梗死患者中无斑块组、单个斑块组和多个斑块组的一般资料

表3 急性脑梗死患者9p21基因多态性与颈动脉斑块的关系

表4 急性脑梗塞患者神经功能缺损与颈动脉斑块的关系

3 讨 论

rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207这6个位点集中在9号染色体长臂21.3区域一段长约100 kb的DNA序列内，与两个已知的抑癌基因-细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子2A和2B(cyclin-dependent kinase inhibitors 2A and 2B，CDKN2A and CDKN2B)处于同一连锁不平衡结构域中。CDKN2A和CDKN2B分别编码CDK4(INK4)家族中的p16INK4a和pl5INK4b及一个与家族抑制子完全无关的蛋白p14ARF，对调节细胞增殖、衰老及凋亡都起着重要作用，并能诱导转化生长因子而影响动脉粥样硬化的发生，可能与既往造成AS的传统危险因素的发生机制有所不同[8]。

许多研究证实染色体9p21.3的基因多态性对脑梗死的作用[9]。同样，也有几项研究已经验证了9p21.3基因突变与颈动脉斑块的相关性。有文献报道，老年患者(>65岁)中rs1333049的C等位基因增加颈动脉斑块风险是G等位基因的1.24倍(95%CI，1.13～1.36；P<0.001)[10]。Lin等还发现rs2383207的G等位基因比C等位基因明显增加颈动脉内膜-中膜厚度(P=0.007)，但只限男性而不是女性[11]。然而急性脑梗死患者9p21.3基因多态性和颈动脉斑块之间的关系目前尚不清楚。本研究中，9p21.3区域6个SNP位点与颈动脉粥样硬化之间无关联性。我们还发现，急性脑梗死发病期有颈动脉斑块的患者有更严重的神经功能缺损。

我们的研究表明颈动脉斑块与急性脑梗死发病时的神经功能缺损有关。另一项研究显示颈动脉狭窄的程度是预测脑梗死症状的唯一依据[12]。在我们的结果中，颈动脉斑块与急性脑梗死的严重程度有关。然而，斑块面积大小对急性脑梗死严重程度没有预测价值。

总之，我们探讨了9p21.3区域的基因多态性(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)这6个位点在急性脑梗死患者颈动脉粥样硬化中的风险作用，急性脑梗死发作时颈动脉斑块与神经功能缺损有关，颈动脉斑块的面积大小与神经功能缺损无明显相关性。但结论仅局限于小范围四家医院的人群和样本的病例对照研究，以后应该进一步扩大样本进行相关前瞻性研究。

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Carotid plaques are associated with variants on Chromosome 9p21.3and neurological dysfunction in acute ischemic stroke

SUNJialan,YANGKang,HUANGShu,etal.

(DeptmentofNeurology,GongliHospital,PudongNewArea,Shanghai200135,China)

Objective To investigate the relationship between chromosome 9p21.3 gene polymorphism and carotid plaques,the correlation with nerve function defect in Chinese han population with acute cerebral infarction.Methods A retrospective case-control study was conducted,including 556 cases of acute ischemic stroke (no plaque for the control group,231 cases,single plaque group,67 cases,plaque group,258 cases),Risk factors,the national institutes of health stroke scale (NIHSS) score at admission were obtained,and carotid ultrasonography was performed to detect carotid plaques.SPSS19.0 software was used for statistical data.Results The average hospitalization days of plaque group was obviously more than no plaque group (P< 0.05).Carotid plaques were positively correlated with NIHSS score on admission to hospital (P< 0.05).In groups both less than or equal to 65 years old and over 65 years old,9 p21zones on all six SNPs (rs10757278 rs1333049 rs2383206,rs1537378,rs4977574 and rs2383207) allele frequency distribution in the absence of plaque group (control group) and plaque group had no significant (P> 0.05).Also found that the presence of carotid plaques lead to severe neurologic deficits (P<0.001;OR=0.001;95%CI,1.54～3.40).Single spot,spot group’s influence on nerve function defect in patients respectively was 1.87 times (95% CI,1.02-3.42;P=1.02) and 2.42 times (95%CI,1.59～3.66;P< 0.001) risk factors than no plaque group.However,the area size of carotid plaques has no obvious correlation with neural function defect.Conclusions Six 9p21.3 regional SNP loci had no correlation with carotid plaques.The onset of acute cerebral infarction patients with carotid plaques have more severe neurologic deficits.

Acute cerebral infarction; 9p21.3 gene polymorphism; Carotid plaques; Neurological dysfunction

1003-2754(2017)04-0295-04

2016-12-20；

2017-03-30

上海市浦东新区科技发展基金创新基金(PKJ2013-Y01)；上海市卫生和计划生育委员会科研资金(201540157)；上海市浦东新区卫生系统领先人才培养计划(PWR12014-05)；上海市浦东新区卫生系统重点学科建设资助(PWZx2014-08)；上海市医学重点专科建设计划项目(ZK2015B16)；上海市自然科学基金项目(15ZR1437200)；国家自然科学基金面上项目(81571203)

(1.上海市浦东新区公利医院神经科,上海 200135； 2.上海交通大学附属瑞金医院神经科，上海 200025)

李龙宣，E-mail:Longxuanlee2006@yahoo.com

R743.3

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