徐瑶瑶, 李思琪, 田雪梅

(华南师范大学生命科学学院, 广州510631)

三种不同固定液对小鼠组织过碘酸雪夫染色效果比较

徐瑶瑶, 李思琪, 田雪梅

(华南师范大学生命科学学院, 广州510631)

目的 比较小鼠肝脏、肾脏、小肠三种组织在质量分数4%多聚甲醛液、Carnoy’s液、Bouin’s液三种固定液不同固定时间下的制片质量和过碘酸雪夫染色(PAS)效果，筛选出一种最为适用的固定方法。方法 取成年雄性C57BL/6小鼠肝脏、肾脏、小肠，分别固定于三种固定液，固定时间分别是质量分数4%多聚甲醛液: 24 h、48 h、72 h; Carnoy’s液: 4 h、8 h、12 h; Bouin’s液：12 h、24 h、48 h，充分固定后，常规制作石蜡切片，然后进行PAS染色，对比观察染色效果。结果 三种固定液对不同组织、不同固定时间下PAS染色结果存在差异。肝脏、肾脏、小肠经Carnoy’s液处理12 h后PAS效果最佳，质量分数4%多聚甲醛液固定24 h基本满足观察检测效果，而经Bouin’s液固定组织染色效果相对较差。结论 PAS反应对固定液和固定时间具有选择性, Carnoy’s 液是组织进行PAS染色的理想固定液，但从固定效果、重复性、安全性、成本等多因素综合考虑，在PAS反应中，质量分数4%多聚甲醛液可以替代Carnoy’s液。

Carnoy’s液; Bouin’s液; 多聚甲醛; 过碘酸雪夫(PAS)染色

过碘酸雪夫(PAS)染色(periodic acid-Schiff stain),是一种常见的组织化学染色方法，主要用于检测多糖和糖蛋白, 现已广泛应用于病理学诊断和鉴别。研究表明[1,2], PAS反应对固定液具有选择性，从而影响制片质量和染色效果。目前固定液的种类很多, Carnoy’s液作为PAS反应的经典固定液, 却存在配制麻烦、重复率低、成本高、不适用免疫组化研究等问题。多聚甲醛(Paraformaldehyde)是目前实验室最常用的固定剂之一, 该固定剂较为温和, 能很好地保存组织的抗原性和细微结构, 适于组织标本和细胞片的较长期保存, 也非常适合组织和细胞的光学显微镜免疫化学研究[3]。如果在PAS反应中，经Carnoy’s液固定的组织染色结果，多聚甲醛处理后也能达到相应要求, 将为今后的病理学研究提供较大帮助。因此, 作者选用了质量分数4%多聚甲醛液、Carnoy’s液、Bouin’s液三种不同的固定液,对小鼠肝脏、肾脏、小肠这三种组织进行不同固定时间处理，对比观察PAS染色结果，以期为今后的研究应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

8～9 周龄SPF级雄性C57BL/6 小鼠，体质量20～25 g ，购自南方医科大学实验动物中心[SCXK (粤)2011-0015]。偏重亚硫酸钠购自天津市永大化学试剂有限公司，苏木精购自广州市斯佳生物科技有限公司，多聚甲醛、高碘酸钠、碱性品红、苦味酸、冰醋酸、无水乙醇、氯仿、盐酸、二甲苯等常用试剂均购自广州化学试剂厂。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制 ①质量分数4%多聚甲醛液: 4 g 多聚甲醛加50 mL蒸馏水, 在通风橱里加热至60 ℃，边搅拌边滴入1 mol/L的NaOH，直到多聚甲醛完全溶解，冷却后加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液定容至100 mL; ②Carnoy’s液: V95%乙醇∶V冰醋酸∶V氯仿=6∶1∶3; ③Bouin’s液: V苦味酸饱和液∶V甲醛:V冰醋酸=15∶5∶1; ④Schiff试剂(热配法): 200 mL蒸馏水煮沸后离火，慢慢加入1.0 g 碱性品红, 搅拌至完全溶解, 冷却至50 ℃时过滤, 加入1 mol/L盐酸5 mL 摇荡，冷却至25 ℃时,加入0.25 g 偏重亚硫酸钠, 密封瓶口, 至暗处或4 ℃冰箱内24 h后溶液呈草黄色，加入0.5 g 活性炭，摇荡1 h后过滤。此时溶液呈无色或淡黄色, 避光, 4 ℃保存备用[4]。

1.2.2 取材、固定和包埋 小鼠引颈法处死。分别取肝脏、肾脏、小肠组织, 冲洗干净后, 立即置于三种固定液中进行固定，固定时间分别为质量分数4%多聚甲醛液: 24 h、48 h、72 h; Carnoy’s液: 4 h、8 h、12 h; Bouin’s液: 12 h、24 h、48 h。待组织固定完全后, 再按照常规石蜡包埋、切片(5 μm)。

1.2.3 PAS染色 切片常规脱蜡至水, 先用1%高碘酸钠溶液氧化10 min，充分水洗后入蒸馏水洗，用Schiff试剂室温暗染5～15 min，流水冲洗10 min，过蒸馏水，苏木精复染10～30 min，盐酸乙醇分化，自来水冲洗至反蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜镜检并采集图像。

2 结果

2.1 三种固定液对小鼠肝脏PAS染色效果

PAS染色肝组织结果(图1、表1)显示, 三种固定液不同固定时间的固定效果存在差异。Carnoy’s液固定肝脏12 h效果最好，肝糖原呈鲜艳的洋红色，细胞核呈蓝紫色，肝小叶结构完整，肝细胞界限清晰, 核质对比明显, 但出现极化现象(图1B)。4%多聚甲醛液固定组织48 h效果较好，肝细胞着色鲜艳，能较好的保存肝糖原(图1A)。Bouin’s液固定肝组织12 h，结构尚清晰，但肝细胞出现空泡样，且随着固定时间的延长增多(图1C)。

2.2 三种固定液对小鼠肾脏PAS染色效果

PAS染色肾组织结果(图2、表2)显示，三种固定液均具有良好的固定效果。肾单位细胞核呈蓝紫色，肾小球毛细血管基底膜、系膜基质，肾小囊壁层基膜，肾小管基底膜均呈鲜艳的紫红色。对比PAS染色阳性部位的着色鲜艳程度和清晰程度，Carnoy’s液优于质量分数4%多聚甲醛液、Bouin’s液(图2B)。Bouin’s液液固定的肾单位细胞界限明显，血管襻的具体结构清晰，近曲小管和远曲小管管腔边缘强阳性(图2C)。而质量分数4%多聚甲醛液固定的肾脏整体着色较深, 肾小球基底膜突出明显,但结构清晰度较Carnoy’s液、Bouin’s液模糊(图2A)。

2.3 三种固定液对小鼠小肠PAS染色效果

PAS染色小肠组织结果(图3、表3)显示，三种固定液固定效果存在差异。Carnoy’s液和质量分数4%多聚甲醛液固定的小肠组织，组织结构清晰，色彩鲜艳，中央糜管、肠腺清楚完整，黏原颗粒清晰可见，细胞核呈蓝紫色, PAS阳性物质集中分布在肠腺上皮杯状细胞, 呈洋红色, 且核质对比明显，固定效果好(图3A、3B)。而Bouin’s液固定的小肠核质比对比不明显，染色效果相对不佳(图3C)。

图 1 三种固定液固定后的小鼠肾组织PAS染色 (400×)Figure 1 PAS staining of liver tissue of mice fixed by three fixatives (400×)

表 1 不同固定液对小鼠肝脏PAS染色效果的比较

图 2 三种固定液固定后的小鼠肾组织PAS染色(400×)Figure 2 PAS staining of kidney tissue of mice fixed by three fixatives (400×)

表 2 不同固定液对小鼠肾脏PAS染色效果的比较

图 3 三种固定液固定后的小鼠小肠组织PAS染色 (200×)Figure 3 PAS staining of small intestine tissue of mice fixed by three fixatives (200×)

表 3 不同固定液对小鼠小肠PAS染色效果的比较

3 讨论

3.1 PAS染色的作用机理

PAS染色是一种常用的组织化学染色方法，主要用于检测糖类化合物。糖被强氧化剂高碘酸氧化后形成多醛，后者在与无色品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合，形成紫红色产物[5]。肝组织的肝糖原、小肠黏膜上皮的杯状细胞，肾脏肾小球和肾小管基底膜，因主要成分是糖原或糖蛋白而表现为PAS阳性[6]。

3.2 三种固定液的优缺点分析

固定的目的在于使蛋白变性、凝固、沉淀，保存细胞和组织的原有形态结构。固定过程中组织结构的保存效果受多种因素影响，如固定液种类、温度、固定时间以及固定后处理方法等。因此选择最合适的固定条件有助于最大程度的保证组织的完整性[7]。

质量分数4%多聚甲醛液能使细胞内的自由氨基基团发生化学交联而使组织固定，该固定液固定均匀，对组织收缩小，用一种简单而有效的抗原修复技术就可以恢复被它减少或变性的抗原适用于形态学和免疫组织化学的固定液，且成本低，是目前病理学家选择的最通用的固定液。Carnoy’s液对核固定优良，可保存Nissl氏物质和糖原; 但它会使组织收缩和变硬并溶掉血细胞，可能会破坏抗酸染色中的抗酸杆菌的染色; 同时对人体有一定的损害，需小心操作。Bouin’s液中的苦味酸可与蛋白基团形成盐而使蛋白凝固，是一种用于结缔组织染色的极好固定剂。苦味酸是一种有剧毒性的黄色结晶体，在干燥空气中有爆炸性，故需保湿保存，给日常使用带来危险[8]。

在本次实验中，Carnoy’s液固定效果优于质量分数4%多聚甲醛液和Bouin’s液，但也出现使糖原颗粒移至细胞一侧的极化现象，影响切片观察。可能是由于含有高浓度的乙醇，当在组织内渗透时向组织中央冲击而引起糖原向细胞一侧偏移造成[9]。同时，Carnoy’s液易引起组织过度硬化导致切片失败。Bouin’s液固定肾脏组织，整体效果较好，但固定的肝脏肝糖原出现部分溶解，小肠组织存在结构界限不清晰，整体着色不鲜艳等问题，说明Bouin’s液不适用于肝脏固定。黄宏森等[10]研究也证实了这一点。由于糖原是水溶性的，所以许多早期研究认为，应避免使用水溶性固定剂，如甲醛。祁珊珊[11]使用质量分数3.7%多聚甲醛固定十二指肠、肾脏组织，结果显示该固定液也可有效保留糖原。本实验经质量分数4%多聚甲醛液固定的三种组织，其PAS阳性物质染色结果基本达到检测观察效果。切片整体着色较深，色泽鲜艳，尤其小肠组织杯状细胞糖原颗粒(中性黏蛋白)清晰，阳性反应强，而Carnoy’s、Bouin’s液组杯状细胞胞质内黏液未出现PAS反应强阳性，可能是因为这两种固定液含有醋酸，细胞易被破坏，较难保存细胞颗粒。

综上所述, 质量分数4%多聚甲醛固定组织48 h可有效保留糖原和糖蛋白, 且染色清晰, 对比度强，固定的组织可用于PAS染色; 从固定效果、重复性、安全性、成本等多因素综合考虑, 在病理学PAS反应中, 质量分数4%多聚甲醛液可以替代Carnoy’s液。

[1] Zakout YM, Salih MM, Ahmed HG. The effect of fixatives and temperature on the quality of glycogen demonstration [J]. Biotech Histochem, 2010, 85(2):93-98.

[2] 吴雨岭, 巫岳龙, 杨晓红, 等. 不同固定剂对PAS染色法显示肝糖原方法的比较研究[J]. 医学信息, 2013(27):236.

[3] Bancroft, John D. Theory and Practice of Histological Techniques [M]. Philadelphia: Churchill Livingstone Elsevier, 2008, 96(1): 47-48.

[4] 蔡文琴. 组织化学与细胞化学技术[M]. 北京:人民卫生出版社, 2014:18.

[5] 邹仲之, 李继承. 组织学与胚胎学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2008:22.

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[9] 张风, 陶艳艳, 陈高峰. 改良PAS染色法在急性肝损伤中的应用[J]. 世界中医药, 2015(2):178-181.

[10] 黄宏森, 张超, 郭晓珍, 等. 不同固定液及固定时间对小鼠肝组织结构的影响[J]. 广州医学院学报, 2007, 35(2):65-68.

[11] 祁珊珊. 过碘酸-Schiff(PAS)染色方法的改良及其在病理诊断中的应用[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016, 32(7): 825-826.

Comparison on Periodic Acid Schiff Staining Effect on Mice Tissues with Three Different Fixatives

XU Yao-yao, LI Si-qi
(School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

ObjectiveThrough comparing the slides qualities and periodic acid Schiff (PAS) staining effects with three different fixatives and fixed time on the normal liver, kidney, small intestine from mice, so as to select the optimum fixed methods.MethodsThe liver, kidney and small intestine tissue from adult male C57BL/6 mice were harvested, then fixed in three fixatives with different times respectively, the 4% paraformaldehyde fluid with 24 h, 48 h, 72 h, the Carnoy’s fluid with 4 h, 8 h, 12 h, and the Bouin’s fluid with 12 h, 24 h, 48 h. After fixed sufficiently, produced paraffin section and then stained routinely with PAS, to observe the staining effect under microscope. Result Different PAS staining results existed among three fixatives with different fixed time on three kind of tissues. The best staining result was observed in Carnoy’s fluid fixed for 12 h, the 4% paraformaldehyde fixed 48 h can basically met the criteria for observation. the staining result was relatively poor fixed in Bouin’s fluid.Conclusion PAS reaction was selective for fixative and fixed time. Carnoy’s fluid is an ideal fixative, but based on the fixed effect, repeatability, safety, and cost, 4% paraformaldehyde fluid can replace Carnoy’s liquid and widely used in PAS reaction.

Carnoy fluid; Bouin’s fluid; Paraformaldehyde fluid; Periodic acid Schiff (PAS) staining

R-331 Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0155-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.014

2016-12-28

广东省重点基金资助项目(2014A020212504)

徐瑶瑶(1991-), 女, 硕士研究生, 从事基因敲除小鼠免疫方面的研究, E-mail: xyyscnu@163.com

田雪梅(1969-), 女, 教授, 博士, E-mail: xmtian69@163.com