徐建平,蔡锦源,李林轩,王萌璇,张彩云,梁豪荣,韦坤华，*,李旻辉,,*

(1.包头医学院,内蒙古包头 0140403;2.广西药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室,广西南宁 530023;3.广西科技大学鹿山学院,广西柳州 545616)

徐建平1,蔡锦源2,3,李林轩2,王萌璇3,张彩云3,梁豪荣3,韦坤华2，*,李旻辉1,2,*

(1.包头医学院,内蒙古包头 0140403;2.广西药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室,广西南宁 530023;3.广西科技大学鹿山学院,广西柳州 545616)

总评归一值,山豆根茎多糖,微波预处理-超声波提取,抗氧化活性,清除亚硝酸盐活性,稳定性

微波预处理-超声波提取法[1]可较好地结合微波内加热破壁破膜和超声波空化、机械搅拌等优点,可快速高效地从植物中提取有效成分,已应用于香菇多糖[1]和山茱萸多糖[2]的提取。总评归一值(Overall desirability,简称OD)法[3]可较全面地将多个指标综合为一个指标,再结合正交设计或响应面法进行工艺优化,为多指标的药用植物有效成分提取工艺优化提供了新的研究思路。

山豆根(SophoratonkinensisGapnep.),又名广豆根[4-5],植物多糖含量约占干药材重量的3%～8%。近年来,山豆根多糖因其具有调节免疫、清除肝炎病毒和抗肿瘤等生物活性[6-8],备受广大学者关注。但目前对山豆根多糖的研究主要集中在根部[9],山豆根茎枝的产量远大于根部,如能对其进行有效的综合开发利用,将有助于推动山豆根药材的综合开发利用。前期实验研究表明山豆根茎部也富含多糖类成分,但目前尚未有关山豆根茎部多糖的提取和生物活性等方面研究的文献报道。本研究旨在以多糖得率和多糖纯度的总评归一值为指标,优选山豆根茎多糖的微波预处理-超声波提取工艺,并对粗多糖进行抗氧化活性、清除亚硝酸盐活性和稳定性三种生物活性进行研究,为筛选山豆根茎多糖的提取方法以及综合开发利用山豆根茎多糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山豆根茎枝 采自广西药用植物园实验田；葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇、石油醚、邻苯三酚、盐酸、三羟甲基氨基甲烷、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸、氯化铝、氯化钠、氯化铜、氯化铁、氯化钙、VC、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺等 均为分析纯。

KQ5200DE型数控超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;G70F20CN3L-C2(B0)格兰仕Galanz微波炉 广东格兰仕微波电器制造有限公司;UV-5100紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;TDL-80-2B低速离心机 上海安亭科学仪器厂;CP225D型精密电子天平(1/10万) 德国LaiLa。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺线路 山豆根茎→切碎→恒温烘干(60 ℃)→粉碎过筛(60目)→石油醚回流脱脂→恒温烘干(60 ℃)→称量并按比例加入解吸剂(超纯水)→微波预处理→按比例加入提取溶剂(超纯水)并进行超声波提取→抽滤→旋蒸浓缩→醇沉(75%乙醇)→离心→固液分离→干燥至恒重(60 ℃)→即得山豆根茎粗多糖。

1.2.2 山豆根茎多糖含量测定、得率和纯度计算 采用苯酚-硫酸法[10]测定多糖含量,以吸光度为纵坐标,总糖浓度为横坐标,回归方程为:A=0.0531X+0.0083,r=0.9999,多糖浓度在2.5～17.5 μg/mL范围内线性关系良好。按方法“1.2.1”制备粗多糖,称重后用蒸馏水复溶并定容,采用苯酚-硫酸法测定吸光度,根据回归方程计算总糖浓度,多糖质量按式(1)计算,多糖得率按式(2)计算,多糖纯度按式(3)计算:

W总糖=N×X/(1000M)

式(1)

y(%)=W总糖/M×100

式(2)

Y(%)=W总糖/m×100

式(3)

注:W总糖为多糖质量,g;X为总糖浓度,mg/mL;y为多糖得率,%;M为投料质量,g;m为粗多糖质量,g;Y为多糖纯度,%。

1.2.3 总评归一值计算 以多糖得率和多糖纯度为指标,采用Hassan法进行归一化处理,多糖得率和多糖纯度取值越大越好,单指标评价值(d)按式(4)进行计算,总评归一值[2]按式(5)进行换算。

d=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

式(4)

OD=(d1+d2)/2

式(5)

其中：d为单指标评价值,d1为多糖得率指标评价值,d2为多糖纯度指标评价值,Yi为指标中第i个值,Ymin为指标中最小值,Ymax为指标中最大值。

1.2.4 正交实验设计 在前期实验的基础上,固定微波功率700 W和提取温度60 ℃的条件下,采用正交表L16(45)对解吸剂比、微波时间、料液比、超声功率和提取时间进行实验设计,因素与水平见表1。

表2 对比实验Table 2 Contrast experiment

表1 正交设计实验因素与水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment

1.2.5 对比实验设计 在正交设计优选的最优工艺条件的基础上,将热水浸提法(a)、超声波提取法(b)与微波预处理-超声波提取法(c)进行比较,对比实验设计见表2。

1.2.6 粗多糖的稳定性实验 按表2的b法和c法分别提取山豆根茎粗多糖,从温度、金属离子、食品添加剂和氧化还原剂四方面考察粗多糖的稳定性,实验方案参考史娟[2]和许小向等[11]的方法并略做修改,具体如下:

光照对粗多糖的影响：取4 mL粗多糖溶液2组,每组各6份,1组在0、2、4、6、8、10 h下见光常温保存,另一组则避光常温保存,按方法“1.2.2”测定吸光度。

温度对粗多糖的影响：取4 mL粗多糖溶液7份,分别在40、50、60、70、80、90、100 ℃下避光保温1 h,按方法“1.2.2”测定吸光度。

金属离子对粗多糖的影响：取4 mL粗多糖溶液6份,分别加入2.0 mL超纯水和浓度为0.05 mol/L的Na+、K+、Ga2+、Cu2+和Fe3+,摇匀后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”测定吸光度。

食品添加剂对粗多糖的影响：取4 mL粗多糖溶液3份,分别加入2.0 mL超纯水、0.05 mol/L的柠檬酸和0.05 mol/L抗坏血酸,摇匀后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”测定吸光度。

氧化还原剂对粗多糖的影响：取4 mL粗多糖溶液14份,分别加入2.0 mL浓度为0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L的双氧水和亚硫酸钠,摇匀后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”测定吸光度。

1.2.8 粗多糖清除亚硝酸盐活性 参考郭小鹏等[14]和李佩艳等[15]的方法并做修改,先配制成浓度为5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液,在锥形瓶中加入2 mL标准溶液和一定体积的粗多糖(或VC溶液),于超声清洗仪中40 ℃放置10 min,加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液混匀,静置5 min,加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺,混匀后静置15 min,最后加蒸馏水定容至50 mL,在538 nm波长处测定吸光度值(A1),以蒸馏水代替标准溶液测定样品空白对照的吸光度值(A2),以蒸馏水代替粗多糖(或VC溶液)测定标准液空白对照的吸光度值(A0)。亚硝酸盐清除率按式(6)计算。按优选的最优工艺提取粗多糖,并稀释成浓度为0.98 mg/mL,另精密称取0.0040 g VC,溶解并定容为100 mL,分别取1、2、4、8、12、16、20 mL按上述方法进行测定。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式(6)

1.3 数据统计分析

采用Excel和Origin7.5等数据处理软件对实验结果进行处理。

2 结果与分析

2.1 正交实验结果

按表1进行正交设计,结果见表3。由表3直观分析可知影响山豆根茎多糖的微波预处理-超声波提取工艺的顺序大小为:提取时间(E)>微波时间(B)>超声功率(D)>解析剂比(A)>料液比(C),最优工艺组合为A2B1C3D2E2,即为解析剂比1∶5 (g/mL)、微波时间30 s、料液比1∶25 (g/mL)、超声功率140 W和提取时间20 min。由表4可知,提取时间、微波时间和超声功率对OD值有显著影响,而解析剂比和料液比对OD值影响不显著。按最优工艺组合进行3次平行提取实验,此时山豆根茎多糖平均得率为3.27%,平均纯度为29.49%,总评OD值为1.04,优于正交实验表中的16个实验组合,表明实验方案设计稳定、可行。

表4 正交实验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

注:*表述影响显著。

表5 对比实验结果Table 5 Results of contrast experiment

表3 正交实验结果Table 3 Orthogonal experiment results

按方法1.2.5的表2进行实验设计,结果见表5。三种方法中,微波预处理-超声波提取法所提取的山豆根茎多糖得率和纯度均为最高,超声波提取法次之,热水浸提法最低;b法与a法比较发现,采用超声波提取比热水浸提法的多糖得率提高了17.30%,而纯度也提高了31.04%;c法与b法对比发现,在超声波提取之前增加微波预处理,山豆根茎多糖得率可提高17.63%,多糖纯度也提高了11.24%。综上所述,表明采用微波预处理-超声波提取法可大大提高山豆根茎多糖的提取效率。

2.2 山豆根茎粗多糖的稳定性实验结果

2.2.1 光照对粗多糖的影响 光照对粗多糖稳定性实验结果如图1所示。由图1可知,不论b法还是c法,所提取的粗多糖,与避光相比,光照对粗多糖的稳定性有一定的影响,且放置2 h后,吸光度随着光照时间的延长而逐渐下降,原因可能是粗多糖可能在光照条件下发生部分分解[2],故建议避光保存。

图1 光照对多糖稳定性的影响Fig.1 Effect of light on the stability of polysaccharose

2.2.2 温度对粗多糖的影响 温度对粗多糖稳定性实验结果如图2所示。由图2可知,b法和c法提取的粗多糖随温度变化,具有相同的变化趋势;在40～70 ℃时吸光度无明显变化,表明稳定性较好,但当温度超过70 ℃以后,吸光度明显增大,原因可能是过高的温度导致粗多糖水解,增大了溶液显色效果[11],故建议采用低于70 ℃的温度进行粗多糖的提取或存放。

图2 温度对多糖稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature on the stability of polysaccharose

2.2.3 金属离子对粗多糖的影响 金属离子对粗多糖的稳定性实验结果如图3所示,由图3可知,两种方法所提取的粗多糖受金属离子的影响趋势相同;在含Ca2+的溶液中吸光度未发生明显变化,即比较稳定;在含Fe3+和Cu2+的溶液中吸光度升高较明显,在含Al3+和Na+溶液中的吸光度下降较多,原因可能是金属离子本身具有一定的颜色或者与粗多糖发生了氧化反应、络合反应等[11],导致粗多糖与金属离子之间结构发生了变化,从而引起吸光度变化明显,即对粗多糖的稳定性影响较大。

图3 金属离子对多糖稳定性的影响Fig.3 Effect of metal ions on the stability of polysaccharose

2.2.4 食品添加剂对粗多糖的影响 食品添加剂对粗多糖的稳定性实验结果如图4所示,由图4可知,与空白对照对比,加入抗坏血酸(VC)后,茎多糖(b)和茎多糖(c)的吸光度均明显增大,而添加柠檬酸对茎多糖(b)和茎多糖(c)的吸光度变化不明显,表明柠檬酸对粗多糖的稳定性无影响,但VC对粗多糖的稳定性影响较大,原因可能是VC抗氧化活性较强,易竞争性发生氧化反应生成过氧化氢,过氧化氢易与粗多糖发生反应,生成深色产物,从而导致吸光度增大[11]。

图4 食品添加剂对多糖稳定性的影响Fig.4 Effect of food additives on the stability of polysaccharose

2.2.5 氧化还原剂对粗多糖的影响 氧化剂和还原剂对粗多糖的稳定性实验结果如图5所示,由图5可知,茎多糖(b)和茎多糖(c)受氧化还原剂的影响变化趋势一致;粗多糖溶液的吸光度随着双氧水浓度的增大而增大,原因可能是多糖与氧化剂发生了反应,生成深褐色产物[11],导致吸光度增大;山豆根粗茎多糖却随着亚硫酸钠浓度的增大而减小,但下降趋势不明显,原因可能是部分多糖被还原剂还原,生成的糖苷数量减少,故吸光度减小。综合表明粗多糖易被氧化,也会被还原,即粗多糖在氧化剂和还原剂的条件下不稳定。

图5 氧化还原剂对多糖稳定性的影响Fig.5 Effect of oxidant and reductant on the stability of polysaccharose

2.3 山豆根茎粗多糖的体外抗氧化实验结果

按方法“1.2.7”测定粗多糖对·OH的清除率,结果如图6所示。由图6可知茎多糖(b)和茎多糖(c)均具有一定的抗氧化活性,且清除效果与多糖浓度呈量效关系,当多糖浓度为1.96 mg/mL时,茎多糖(b)和茎多糖(c)对·OH的清除率分别为68.57%和78.14%;相同浓度下,茎多糖(c)对·OH清除率高于茎多糖(b),但两种方法提取的粗多糖抗氧化效果均不如阳性对照VC。

图6 多糖对·OH自由基的清除能力Fig.6 ·OH scavenging ability of polysaccharose

图7 多糖对自由基的清除能力

2.4 山豆根茎粗多糖对亚硝酸盐的清除效果

按方法“1.2.8”分别测定粗多糖和VC对亚硝酸盐的清除率,结果如图8所示。由图8可知粗多糖对亚硝酸盐具有良好的清除作用,随着提取液添加量的增大,清除作用也逐渐增大,表明粗多糖与亚硝酸盐清除率存在量效关系;两种方法所提取的粗多糖,在相同浓度下,清除亚硝酸盐能力相当;在实验范围内,粗多糖对亚硝酸盐的清除作用均低于同添加量的VC;当粗多糖(c)溶液添加量为20 mL(多糖重量为19.60 mg)时,亚硝酸盐清除率达82.95%,与8 mL VC(0.32 mg)清除率(83.01%)相当。

图8 多糖对亚硝酸盐的清除作用Fig.8 Scavenging activity on nitrite of polysaccharose

3 结论

[1]蔡锦源,朱炽雄,孙松,等.香菇多糖的微波预处理-超声波提取工艺及其抗氧化活性研究[J]. 河南工业大学学报自然科学版,2016,37(4):84-90.

[2]史娟. 微波预处理-超声波提取山茱萸多糖及稳定性研究[J].食品研究与开发,2014,35(1):1-5.

[3]张林,李元波,张爱军.总评“归一值”优选银马口服液的澄清工艺[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(2):24-27.

[4]赖红芳,黄秀香,陆俊宇. 超声波辅助提取山豆根中的黄酮和多糖工艺优化[J].食品与机械,2014,30(1):196-199.

[5]Wei KH,Li LX,Huang YC,Wang,et al. Tissue culture of Sophora tonkinensis Gapnep. and its quality evaluation[J]. Pharmacognosy Magazine,2013,9:321-328.

[6]Zhang JP,Zhang M,Zhou JP,et al. Antifibrotic effects of matrine oninvivomodels of liver fibros is in rats[J]. Acta Pharmacol Sin,2001,22(2):183-185.

[7]帅学宏,胡庭俊,曾芸,等. 山豆根多糖对免疫抑制模型小鼠免疫器官指数和自由基相关酶活性的影响[J].南京农业大学学报,2009,32(2):170-172.

[8]陈云,曾玲,熊文,等. 山豆根多糖及其硫酸酯体外抗DHV-1感染细胞作用的比较[J].南京农业大学学报,2014,37(4):117-122.

[9]蔡锦源,朱炽雄,李林轩,等. 山豆根多糖的微波预处理-热水浸提工艺及其抗氧化活性研究[J].应用化工,2016,45(10):1860-1864.

[10]蔡锦源,陈玲,张英,等. 雪莲果低聚糖的微波辅助提取工艺研究[J].食品工业,2015,36(10):137-140.

[11]许小向,洪艳平,胡捷敏,等. 松针多糖提取工艺及稳定性研究[J].食品科技,2015,40(6):218-223.

[12]邹林武,赵谋明,游丽君. 香菇多糖提取工艺的优化及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2013,34(19):177-182.

[13]罗秋水,杜华英,熊建华,等.葛根异黄酮类化合物提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J]. 中国食品学报,2015,15(2):104-110.

[14]郭小鹏,田呈瑞,高春燕,等.黄参粗多糖脱蛋白工艺以及对亚硝酸盐清除作用的研究[J]. 食品工业科技,2011,32(2):247-249.

[15]李佩艳,韩四海,罗登林,等.牡丹叶黄酮的酶法提取条件优化及其对亚硝酸盐的清除作用[J]. 食品科学,2016,37(6):77-81.

Optimization of ultrasonic extraction coupled with microwave treatment of polysaccharose fromSophoraTonkinensisGapnep. by overall desirability and its biological activity

XU Jian-ping1,CAI Jin-yuan2,3,LI Lin-xuan2,WANG Meng-xuan3,ZHANG Cai-yun3, LIANG Hao-rong3,WEI Kun-hua2，*,LI Min-hui1,2，*

(1.Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia 014040,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant,Nanning 530023,China; 3.Lushan College of Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545616,China)

overall desirability;S.tonkinensispolysaccharose;ultrasonic extraction coupled with microwave treatment;antioxidant activity;nitrite scavenging activity;stability

2016-10-24

徐建平 (1992-)，女，硕士，从事中药资源学研究， E-mail:xu_jianping1992@163.com。

*通讯作者:韦坤华 (1983-)，女，博士，副研究员，从事药用植物生物技术研究，E-mail:divinekh@163.com。 李旻辉 (1978-)，男，博士，教授，从事中药资源学研究，E-mail:li_minhui@aliyun.com。

国家中医药行业科研专项(201507002)；国家自然科学基金项目(81460582, 81473309)；国家科技重大专项(2012ZX09304006)；广西自然科学基金项目(2013GXNSFBA019086)；广西大学生创新创业训练计划项目(201613639005)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0187-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.028