游玟娟,温拥军

(湖南化工职业技术学院,湖南株洲 412004)

游玟娟,温拥军

(湖南化工职业技术学院,湖南株洲 412004)

为了进一步提高洛伐他汀产量,对实验组前期获得的洛伐他汀高突变株Monascussp.UV-D-9的发酵条件进行了响应曲面优化。获得最佳发酵条件为:发酵温度30.4 ℃,装液量134 mL,转速187 r·min-1,其他条件为发酵时间10 d,接种量 8%。在此条件下,洛伐他汀的产量为(0.32±0.014) mg·mL-1(n=3),比原始条件的产量提高了10.1%。

洛伐他汀,红曲霉UV-D-9,响应曲面法,发酵条件,优化

洛伐他汀(Lovastatin)是一种重要的降血脂、降胆固醇药物,目前在临床上应用十分广泛。洛伐他汀的开环羟基酸部分与体内的羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的化学结构十分相似,作为底物结构类似物,洛伐他汀会对HMG-CoA的代谢过程中的关键酶产生竞争性抑制作用导致体内胆固醇合成量减少,从而对高胆固醇血症、动脉粥样硬化、高血压等因胆固醇升高引起的疾病起到防治作用[1-5]。伴随着生活水平的提高,近年来我国民众饮食结构和习惯都发生了很大改变,过多摄入高热量、高脂质、高胆固醇的食物导致动脉粥样硬化、高血脂、冠心病等“富贵病”的发病率不断提高,使得洛伐他汀等他汀类药物的市场需求日益增大。

洛伐他汀是真菌的次级代谢产物,主要生产菌种有青霉菌、红曲霉和土曲霉等[6-8]。微生物发酵工业中,影响产量的两个关键因素是生产菌种和发酵条件。在红曲霉发酵生产洛伐他汀的研究方面,对菌种改良或发酵条件优化单独研究的报道很多。如李尽哲[9]等利用超高压对红曲霉进行诱变处理,选育出一株洛伐他汀高产突变株HQ2,其洛伐他汀产量达到3.43 mg/g,相对于出发菌株提高了52.4%;李晶[10]等人研究了红曲霉M7固态发酵工艺条件,确定固态发酵最佳工艺为发酵温度26～28 ℃,发酵时间18～20 d,发酵基质初始含水量50%,发酵基质初始pH自然。但对应用响应面优化技术对发酵条件进行系统性研究鲜见报道。为系统地研究洛伐他汀生产的关键影响因素,进一步提高洛伐他汀产量,本课题组采用响应曲面法对前期获得的高产洛伐他汀红曲霉突变株Monascussp.UV-D-9[11]的发酵条件进行优化,旨在为洛伐他汀工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种:红曲霉Monascussp.UV-D-9,为课题组通过UV与DES复合诱变处理所获得的高产突变株,其在温度为32 ℃、转速为160 r/min的条件下发酵10 d,其洛伐他汀产量达到0.289 mg·mL-1,保藏于本院生物制药国家重点实训基地;斜面培养基(PDA) 马铃薯20%(煮烂后取汁),蔗糖2%,琼脂2%;种子及发酵培养基均为PD液体培养基 马铃薯20%(煮烂后取汁),蔗糖2%;洛伐他汀标准品 纯度≥98%,上海永叶生物科技有限公司。

DZ4-0.8A离心机 北京医用离心机厂;HPS-250生化培养箱 哈尔滨东明医疗仪器设备厂;CBV-1500A超净工作台 上海瑞仰净化装备有限公司;QYC.210摇床 上海福玛实验设备有限公司;P1201高效液相色谱仪 戴安中国有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液的制备 在超净工作台上,取2环红曲霉孢子至250 mL摇瓶(内装150 mL种子培养基)中,将摇瓶置于32 ℃恒温摇床上,于160 r·min-1的转速条件下进行培养,直至溶液出现浅红色。

1.2.2 单因素实验方法

1.2.2.1 发酵时间对洛伐他汀产量的影响 取250 mL摇瓶6个(内装100 mL PD培养基),按8%比例接入种子液,置于转速为160 r·min-1、温度为32 ℃的摇床分别发酵2、4、6、8、10、12 d(以接种时间计,下同),测定洛伐他汀的产量,确定最佳发酵时间。

1.2.2.2 发酵温度对洛伐他汀产量的影响 取250 mL摇瓶6个(内装100 mL PD培养基),按8%比例接入种子液,分别置于温度分别为26、28、30、32、34、36 ℃,转速160 r·min-1的摇床发酵10 d。

1.2.2.3 摇床转速对洛伐他汀产量的影响 取250 mL摇瓶6个(内装100 mL PD培养基),按8%比例接入种子液,分别置于转速为140、160、180、200、220、240 r·min-1,温度为32 ℃的摇床发酵10 d。

1.2.2.4 接种量对洛伐他汀产量的影响 取250 mL摇瓶6个(内装100 mL PD培养基),分别接入2%、4%、6%、8%、10%、12%的种子液,于温度为32 ℃、转速为160 r·min-1的摇床发酵10 d。

1.2.2.5 装液量对洛伐他汀产量的影响 取250 mL摇瓶6个(内装100 mL PD培养基),按8%比例接入种子液,置于转速为160 r·min-1,温度为32 ℃的摇床发酵10 d。

1.2.3 响应面优化方法 在分析单因素实验结果基础上,选取对洛伐他汀产量影响最为显著的3个关键因素,按照Box-Behnken设计对发酵条件进行3因素3水平优化。

1.2.4 洛伐他汀样品液的制备 用离心试管取一定量的发酵液置于4000 r·min-1的离心机上离心15 min,取上清液经12层纱布过滤所得澄清液体,再过0.22 μm微孔滤膜即得洛伐他汀样品液。

1.2.5 洛伐他汀含量测定 根据文献[12],测定条件为:色谱柱:XDB C18柱,检测波长237 nm,流动相:甲醇∶水(体积比为70∶30),柱温26 ℃,体积流量1.0 mL/min,进样量20 μL。

1.2.6 数据分析与处理 采用mintab15.0软件对实验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 发酵时间对洛伐他汀产量的影响 从图1可知,发酵时间在2～10 d内,洛伐他汀产量随时间的增加而增加,在10 d时达到量高值0.281 mg·mL-1。继续延长发酵时间,洛伐他汀产量基本保持稳定。其原因是洛伐他汀是红曲霉的次级代谢产物,其积累速度与菌体生长不一致,有明显的“滞后性”,当菌体开始衰退时产量达到最高,之后会随菌体的衰退而下降。因此,从时间与效益综合考虑,发酵时间选10 d为佳。

图1 不同发酵时间洛伐他汀生成量的变化曲线Fig.1 Change curve of fermentation time on lovastatin yield

2.1.2 发酵温度对洛伐他汀产量的影响 一般来讲,微生物在一定条件下发酵,均存在一个最利于发酵产物积累的温度,真菌的最适发酵温度一般在28～32 ℃左右[13]。从图2结果来看,洛伐他汀生成量随发酵温度的变化曲线图呈“钟罩形”。单因素方差分析结果表明,温度对红曲霉发酵生产洛伐他汀存在显著影响(p<0.05)。当发酵温度在26～30 ℃范围内,洛伐他汀产量随温度增加而增加,在30 ℃时达到最大值0.278 mg·mL-1。当发酵温度超过30 ℃时,洛伐他汀产量随温度增加而下降十分明显。其原因在于温度过低,菌体生长缓慢而影响产物的生成,而温度过高则菌体生长代谢旺盛,消耗营养物质和能量较多,不利于产物的积累,因此,最适发酵温度为30 ℃。

图2 不同发酵温度洛伐他汀生成量的变化曲线Fig.2 Change curve of fermentation temperature on lovastatin yield

图3 不同转速下洛伐他汀的生成量Fig.3 Production of lovastatin under different revolution

2.1.3 转速对洛伐他汀产量的影响 由图3可以看出,洛伐他汀生成量随转速变化的曲线图也呈“钟罩形”,经单因素方差分析发现,转速对洛伐他汀产量有显著影响(p<0.05)。当转速为180 r·min-1时,洛伐他汀产量最高,达到0.294 mg·mL-1,降低或升高转速,洛伐他汀产量均明显下降。转速对发酵结果的影响具有“两面性”,一方面保持一定的摇床转速能促进气液间传质,增加溶氧量有利于发酵,进而能提高洛伐他汀产量;另一方面当转速过快时,会产生过大的剪切力,损伤红曲霉菌丝体而导致产量下降，故最佳转速为180 r·min-1。

2.1.4 接种量对洛伐他汀产量的影响 从图4可知,接种量2%～8%范围内,洛伐他汀产量随接种量的增加而增加;但当接种量>8%后增速不明显,当接种量>10%后反而有所下降。原因是接种细胞密度越大,则达到生长饱和的时间越短,因此适当增加接种量,能节约生产时间,但接种量太大则会增加制备种子液的成本。综合考虑,应选择8%的接种量为最佳。

图4 不同接种量下洛伐他汀生成量Fig.4 Production of lovastatin under different inoculum concentration

2.1.5 装液量对洛伐他汀产量的影响 由图5可知,洛伐他汀浓度随装液量的增加而逐渐减少,而每个摇瓶中洛伐他汀的总产量则随装液量的增加而呈先升后降的趋势。经单因素方差结果表明,装液量对洛伐他汀产量有显著影响(p<0.05)。原因是装液量对液体发酵溶氧量影响较大,装液量少时溶氧高,装液量多时因摇瓶中的液面较高而限制了气液间的传质,导致溶氧低。当装液量为120 mL时,单个摇瓶中洛伐他汀的总产量达到最大值为31.32 mg,此时洛伐他汀浓度也处于较高水平,为0.261 mg·mL-1。综合考虑,装液量宜选120 mL为佳。

图5 不同装液量下洛伐他汀生成量Fig.5 Production of lovastatin under different medium volume

2.2 响应面实验结果与分析

根据单因素实验结果,选取对洛伐他汀产量有显著影响的3个因素(即温度(X1)、装液量(X2)、转速(X3)),按Box-Behnken设计进行响应面优化分析,其它因素控制在最佳水平,共进行15次实验,其中中心点重复3次,用来估算误差。

表1 Box-Behnken设计及实验结果Table 1 Box-Behnken design and experimental results

2.2.1 模型的拟合与回归分析 利用mintab15.0软件对表1所得的数据进行二次多元回归拟合,得到回归模型:

表2 模型的方差分析Table 2 Variance analysis of model

2.2.2 响应面优化的直观分析 响应面图能直观反映各因素对响应值的影响,等高线图则反映因素间的交互作用[14]。采用mintab15.0软件绘制响应面图和等高线图(如图6～图8),从图6可以看出,当转速固定在X3=0时,等高线呈椭圆形,说明温度与装液量交互作用显著,当温度为30.1 ℃时,装液量在100～134.6 mL范围内,洛伐他汀产量随装液量增加而增加,当装液量>134.6 mL后,则随装液量增加洛伐他汀产量反而下降,当装液量为134.6 mL时,洛伐他汀产量存在最大值0.3197 mg·mL-1。从图7可以看出,当装液量固定在X2=0时,等高线呈椭圆形,说明温度与转速也存在显著的交互作用。当温度为30.5 ℃时,转速在160～187 r·min-1范围内,洛伐他汀产量随转速增加而增加,而当转速在187～200 r·min-1范围内,洛伐他汀产量随转速增加反而下降,当转速为187 r·min-1时,洛伐他汀产量存在最大值0.3175 mg·mL-1。而图8的等高线呈圆形,说明装液量与转速的交互作用不显著。

图6 Y=f(X1,X2)响应面立体分析和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of y=f(X1,X2)

图7 Y=f(X1,X3)响应面立体分析和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of y=f(X1,X3)

图8 Y=f(X2,X3)响应面立体分析和等高线图Fig.8 Response surface and contour plots of y=f(X2,X3)

30.4 ℃,装液量为134 mL,转速187 r·min-1,该优化条件下模型预测值为0.319 mg·mL-1。验证实验结果为(0.32±0.014) mg·mL-1(n=3),与模型预测值基本接近,说明该拟合模型可以较好地用于结果预测。

3 结论

本实验采用Box-Behnken设计对红曲霉高产突变株Monascussp.UV-D-9发酵生产洛伐他汀条件进行了响应面优化研究。通过单因素实验确定了对洛伐他汀产量影响显著的因素及进行Box-Behnken实验水平,即发酵温度28～32 ℃,装液量100～140 mL,转速160～200 r·min-1。在此基础上,运用Box-Behnken实验设计响应面优化技术对发酵条件进行了进一步的优化,得到最佳发酵条件为:发酵温度30.4 ℃,装液量为134 mL,转速187 r·min-1,其他条件为发酵时间10 d,接种量8%。在此条件下,洛伐他汀的产量为(0.32±0.014) mg·mL-1(n=3),与模型预测结果0.319 mg·mL-1基本接近。优化后的洛伐他汀产量相对于原始条件提高了10.1%。

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2.2.3 最优条件的求解与验证实验 通过对模型求偏导,解逆矩阵得到回归方程最优解,即x1=0.21、x2=0.71、x3=0.35,转化为实际水平可得:发酵温度

Optimization of fermentation conditions on lovastatin yield byMonascussp.UV-D-9

YOU Wen-juan,WEN Yong-jun

(Hunan Chemical Industry Vocational Technology Institute,Zhuzhou 412004,China)

The fermentation conditions ofMonascussp. UV-D-9,which was a high-yield mutant obtained by complex mutagenesis,were optimized by Response Surface Methodology(RSM)to further improve lovastatin yield.The optimum fermentation conditions were received as follows:the fermentation temperature(X1)was 30.4 ℃,the medium volume(X2)was 134 mL,the rotation speed(X3)was 187 r·min-1,fermentation time was 10 d and inoculation amount was 8%. The lovastatin yield ofMonascussp.UV-D-9 under the optimum conditions was(0.32±0.014)mg·mL-1(n=3),which was increased by 10.1% in comparison with the original condition.

lovastatin;Monascussp.UV-D-9.;RSM;fermentation condition;optimization

2016-09-14

游玟娟(1981-),女,本科,讲师,研究方向:微生物育种技术,E-mail:55073160@qq.com。

湖南省教育厅科学研究项目(15C0466)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0141-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.019