林 祎,丁 甜,2，刘东红,2,*，王文骏

(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058; 2.浙江大学馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

声热复合对沙门氏菌的杀菌效果研究

林 祎1,丁 甜1,2，刘东红1,2,*，王文骏1

(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058; 2.浙江大学馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

高效低营养组分影响的新型杀菌技术研究一直被广为关注。本文以复原全脂乳为介质,接种沙门氏菌后,分析了温度、时间及功率对声热复合杀菌效果的影响,并对杀菌前后样品的理化性质进行了比较。结果表明:影响杀菌效果的因素大小顺序为:温度、超声时间和超声功率;灭菌对数值为5.0(即杀死99.999%的沙门氏菌)的优化杀菌条件为超声时间8.8 min,超声功率307 W,超声温度50 ℃,在此条件下处理不但对样品理化品质影响小,而且能够显著降低样品脂肪球直径(p<0.01),脂肪球直径降为处理前的17.86%。说明声热复合杀菌技术可作为一种潜在的杀菌技术应用于液态乳杀菌。

沙门氏菌,声热复合技术,杀菌,响应面法

牛乳含有丰富营养成分,如蛋白、脂肪、氨基酸、乳糖、矿物质等,被认为是一种营养价值非常高的食品,同时也是微生物生长繁殖理想的培养基[1]。因此,在牛乳加工过程中,杀菌成为必不可少的一个重要环节[2]。目前,牛乳生产中常采用热力杀菌,主要有巴氏杀菌、高温短时杀菌、高温长时杀菌和超高温瞬时杀菌[3-4]。但是牛乳热杀菌不仅在加热过程中引起营养成分破坏或损失,而且在杀菌结束或经长时间贮藏后会发生“褐变”,降低牛乳感官品质[5]。而非热加工技术处理条件相对温和,对食品固有营养成分、风味、质构、色泽破坏小,不仅能达到杀菌效果,还能最大程度地保留食品固有的营养价值,因此非热加工已成为食品加工技术领域的研究热点[6-7]。

超声波在食品工业中被认为是一种环境友好型的杀菌手段[8],有研究发现通过超声处理,能够有效降低食品中细菌总数、大肠菌群和粪大肠菌群,并且其灭活率随超声处理时间的延长而增加[9-10]。尽管单独应用超声处理具有较好的杀菌效果,然而要实现杀菌率接近100%,会增加超声功率和处理时间以及增加杀菌成本,从而限制了超声杀菌技术的实际生产应用。虽然有研究表明超声波协同其他技术,能够增强杀菌效果,如在牛奶、蒸馏水、甘油介质中,声热联用技术可以缩短枯草芽孢杆菌及其孢子的杀灭时间,并且能够降低枯草芽孢杆菌孢子的热抗性[11-12],施红英等[13]发现在52 ℃下,声热联用对鼠伤寒沙门氏菌的致死具有协同作用。目前,声热复合对接种到食品中的沙门氏菌杀菌效果的研究还较为少见。因此,本文通过响应面法来研究和预测声热复合对沙门氏菌的杀菌效果,并且优化其灭菌条件,最后比较声热复合杀菌处理前后样品的理化性质,以期为声热复合杀菌技术在食品工业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全脂奶粉 新西兰米勒根斯食品集团有限公司;营养肉汤培养基(Nutrient Broth,NB)、SS琼脂培养基(Salmonella-Shigella Agar)、平板计数培养基(Plate Count Agar,PCA)、鼠伤寒沙门氏菌SalmonellaTyphimurium(ATCC14028-3) 青岛海博生物技术有限公司;酚酞、淀粉酶、偏磷酸、亚铁氰化钾、乙酸钠、硼酸、邻苯二胺、维生素C、盐酸、氢氧化钠、氯化钠等 均为分析纯,国药基团化学试剂有限公司。

TS-2102C 摇床 上海天呈实验仪器制造有限公司;LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司;TGL20M离心机 湖南凯达科学仪器有限公司;JY92-IIDN 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司;KONICA MINOLTA CM-700d分光测色计 柯尼卡美能达办公系统(中国)有限公司;UB200i系列生物显微镜 重庆澳浦光电技术有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 将冻干管中的沙门氏菌菌种接种到NB培养基中进行纯培养,培养液与50%的甘油1∶1混合于甘油管中-80 ℃保存备用。从甘油管中挑取一环菌液于SS琼脂培养基平板划线获得沙门氏菌单菌落(24 h)。取单菌落到NB培养基中,37 ℃、150 r/min 摇床振荡培养18 h,然后在4 ℃下,5000 r/min离心10 min,弃上清液,所得菌体用0.85%生理盐水洗涤2 次,制成浓度为 109～1010CFU/mL的菌悬液,4 ℃冷藏备用[14-15]。

1.2.2 声热复合杀菌

1.2.2.1 样品准备 准确称取一定量全脂乳粉,按照1∶8的比例添加纯净水,搅拌混匀后,在121 ℃下,灭菌15 min,冷却后制成无菌复原全脂乳,按照体积比100∶1的比例接种1.2.1的菌悬液,即实验样品。

1.2.2.2 单因素实验 固定超声波细胞粉碎机的频率为20 kHz,振幅为110 μm,并将其钛合金变幅杆用75%酒精浸泡30 min后用无菌去离子水冲洗3遍。取30 mL 1.2.2.1的菌液转入无菌超声玻璃管(28 mm OD×100 mm H)中并将其置于恒温水浴锅中使菌液预热到设定温度,随后在不同超声时间(3～15 min)、超声功率(100～500 W)和温度(35～55 ℃)条件下进行超声处理。固定超声功率400 W,恒温水浴温度50 ℃研究不同处理时间(3、6、9、12、15 min)对沙门氏菌的杀灭效果;固定时间9 min,温度50 ℃研究不同功率(100、200、300、400、500 W)对沙门氏菌的杀灭效果;固定时间9 min,功率400 W研究不同温度(35,40、45、50、55 ℃)对沙门氏菌的杀灭效果,处理完成的样品迅速于4 ℃下冷却并采用平板计数法(GB4789-2010)测定其菌落总数,每个处理重复三次。

1.2.2.3 响应面实验 根据Central Composite实验设计原理,以灭菌对数值NK(R)和杀菌率(%)为指标,在单因素实验的基础上,选取超声温度、超声时间、超声功率三个因素为自变量,设计了3因素5水平的响应面实验。实验因素水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 The response surface experiment factor level table

1.2.3 灭菌对数值Nk和杀菌率计算

Nk=lg(N0/N)

杀菌率(%)=(N0-N)/N0×100

式中:N-经灭菌处理后平板上可见的菌落总数,CFU/mL;N0-灭菌处理前的菌落总数,CFU/mL。

1.2.4 理化性质测定

1.2.4.1 实验设计 为了分析声热复合处理对样品理化品质的影响,取15支超声玻璃管,每支管中注入30 mL复原全脂乳,以响应面法得出的最优条件进行杀菌后,样品分别用于维生素C、pH、滴定酸度、色度、脂肪球直径等指标测定,然后与未经处理的样品进行比较。

1.2.4.2 各指标的实验方法 维生素C:GB 14754-2010食品安全国家标准食品添加剂维生素C(抗坏血酸);pH:pH计法;滴定酸度:GB 5413.34-2010 乳与乳制品酸度的测定;色度:利用色差仪对表征牛乳样品色泽的L*、a*、b*值进行测定,每个样品平行测定3次;脂肪球直径:加一滴液态乳样品于载玻片上,再滴2～3滴苏丹Ⅲ染液染色3 min,盖上盖玻片,用吸水纸吸取周围多余样品,显微镜目镜10倍,物镜100倍下用油镜观察并拍片记录,测量视野内任意4 cm2所有脂肪球的直径大小,计算其平均值与直径范围。

1.2.5 数据处理 数据结果采用x±s表示,方差分析采用SPSS 20.0分析,多重检验采用Tukey检验法,显著水平取0.05。

2 结果与讨论

2.1 杀菌时间对沙门氏菌的杀菌效果

由图1可见,随着超声杀菌时间的延长,沙门氏菌的灭菌对数值Nk也不断增加。当处理时间3～6 min内时,灭菌对数值增加速度最快,增加到5.17,而6 min到15 min这段时间的灭菌对数值增长趋于平缓,灭菌对数值只增加了1.54。这与传统热杀菌处理中杀菌时间对微生物的致死趋势相似,时间越长杀菌效果越好;而两者对微生物致死趋势的不同点在于声热复合杀菌前期灭菌对数值增长很快,到达一定值后增长逐渐变缓,而传统热杀菌处理前期灭菌对数值增长较慢,经过一定时间后灭菌对数值才会以较快且较为平稳的速度增长[16]。

图1 时间对杀菌效果的影响Fig.1 Influence of time on the sterilization effect注:标注不同字母的表示有显著性差异, p<0.05，图2，图3同。

2.2 超声功率对沙门氏菌的杀菌效果

如图2所示,随着超声功率的增加,沙门氏菌的灭菌对数值也不断提高。当超声功率从100 W增加到400 W,从3.92提升到5.45,各处理的灭菌对数值差异显著(p<0.05),而400 W(5.45)和500 W(5.50)两个处理间差异不显著(p>0.05)。一般认为,超声波对液体中微生物杀灭作用的机理主要是空化效应,液体中的微小液泡表现为振荡、生长、收缩及崩溃等一系列动力学过程,在液泡破裂会产生局部瞬间高温和高压,使细菌的细胞壁或细胞膜受到急剧的破坏,导致细菌死亡[17]。虽然500 W与400 W杀菌效果一样好,但是500 W处理能耗相对高,选择超声功率400 W较为适宜。

图2 超声功率对杀菌效果的影响Fig.2 Influence of ultrasonic power on the sterilization effect

2.3 超声温度对沙门氏菌的杀菌效果

由图3可见,随着超声温度升高,对沙门氏菌的灭菌对数值也不断提高。35 ℃和40 ℃处理的杀灭效果差异不显著(p>0.05),并且对沙门氏菌的杀灭都相对较低,说明在低温条件下,即使联合超声处理,杀灭效果也并不理想。但当处理温度超过45 ℃后,灭菌对数值显著提升(p<0.05),可以从原来的1.70(35 ℃)提升至6.08(55 ℃)。与传统热杀菌处理中温度对微生物的杀灭规律相似,温度越高,灭菌对数值越大[17],不过在超声复合的作用下,能够在相对较低的温度环境下,就获得较好的杀菌效果,而根据施红英等[13]的研究发现,传统热杀菌在52 ℃下处理40 min能降低的水中鼠伤寒沙门氏菌灭菌对数值为1.2,在全脂乳介质中这个值会更低。从单因素结果来看,55 ℃处理的杀灭效果最好。

图3 超声温度对杀菌效果的影响Fig.3 Influence of temperature on the sterilization effect

2.4 声热复合杀菌条件优化

该研究选用Central Composite Design中心组合实验设计,共有20组实验,其中包括14组析因实验和6组重复实验。采用Design-Expert8.06分析软件辅助设计响应面实验,实验设计及结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Designs and results for extraction of response surface experiments

对表2数据进行响应面多元回归分析,获得了3个因素与沙门氏菌灭菌对数值之间的模拟回归方程为:

Nk=3.72+0.80A+0.48B+1.84C-0.44A2+0.049B2-0.031C2+0.17AB+0.14AC+0.017BC

为了了解该回归模型拟合度,对模型进行了显著性检验及方差分析,结果见表2。

表3 方差分析Table 3 The variance analysis

注:p<0.01,极显著“**”;p<0.05,显著“*”。 表2中方差分析结果显示,对回归模型的F检验,该模型达到极显著(p=0.0001<0.01),失拟项p=0.4220>0.05,表明模型的失拟度不显著,该回归模型预测值与实测值能较好的吻合。进一步分析,由F值判断各因素对沙门氏菌灭菌对数值影响的强弱,F值越大,影响作用越强。因此,各因素对沙门氏菌灭菌对数值影响程度大小依次为超声温度C>超声时间A>超声功率B。

由Design Expert8.06软件分析获得了各因素交互作用的响应面图见图4,各因素交互作用对灭菌对数值的影响,随着温度和时间增加,响应值一直呈上升趋势;而随着超声功率增加,响应值先增加后趋于稳定。由于等高线形状与因素间交互作用的显著性有关,圆形等高线表明因素间交互作用不显著,椭圆等高线表明因素间交互作用显著[18],由图4可知,功率、时间和温度相互间的等高线图都呈非椭圆形,表明3因素间交互作用不显著,并且方差分析也证明该模型中因素之间交互作用不显著(p>0.05)。

图4 各因素及其交互作用对NK值的响应曲面图Fig.4 Response surface of factors and their interaction on NK

因为美国FDA推荐致病菌的灭菌对数值为5.0,因此以沙门氏菌灭菌对数值5.0(杀菌率99.999%)为目标,由Design-Expert8.06运算获得沙门氏菌杀灭效果的最优条件:超声时间8.77 min,超声功率307 W,温度49.84 ℃,在该条件下,模型预测的灭菌对数值为4.9999(杀菌率99.999%)。同时做了3次平行验证实验,为了便于参数设置,具体实施条件为,超声时间8.8 min,超声功率307 W,温度50 ℃,获得灭菌对数值为5.17±0.21(杀菌率>99.999%)。对验证值与预测值进行t检验,t=0.941

2.5 理化性质分析

由表3可以看出,与未经处理的样品比较,声热复合处理后,样品的pH、滴定酸度、L*、a*均未发生显著变化(p>0.05),声热复合处理后pH和滴定酸度均略有上升,说明样品中氢离子浓度略有下降,但由于蛋白质和脂肪水解、乳糖降解等原因,样品中的酸性物质总量还是呈上升趋势[19];虽然VC损失率(%)达到10.6%±2.29%,但与传统杀菌中VC损失率达40%～60%相比[20],声热复合处理对牛乳中VC的损失相对较小;杀菌后的样品b*显著高于处理前(p<0.05),说明杀菌后样品色泽有一定的加深,同样于传统杀菌报道的色泽变化比较[21],声热复合对样品的L*和a*影响相对较小(p>0.05);此外,杀菌处理后,牛乳的脂肪球直径显著降低(p<0.01),仅为处理前的17.86%。有文献报道[22]超声处理具有均质的作用,说明声热复合杀菌处理后,更有利于牛乳中脂肪球稳定。总的来看,声热复合处理能够杀灭沙门氏菌的同时,对牛乳中的理化性质影响不显著或相对较小。

表3 声热复合杀菌处理前后的样品理化品质Table 3 The physic-chemical parameters of pre-and post-treatment samples

注:按照100 mL液态乳添加15 mg的比例添加VC标准品,然后进行声热复合杀菌处理，同一个指标，不同字母表示有显著差异(p<0.05)。

此外,与传统液态乳杀菌方法(低温长时巴氏杀菌法:LTLT,63 ℃,30 min;高温短时巴氏杀菌:HTST,72 ℃,15 s)[23]比较,声热复合处理能够明显降低杀菌温度,而杀菌时间介于两种巴氏杀菌之间,说明声热复合杀菌技术有较大的应用前景。下一步工作应该开展声热复合技术对其他常见病原菌的杀菌效果,以及在原料乳杀菌中实际应用方面的研究。

3 结论

在复原乳中,声热复合技术能够有效杀灭沙门氏菌,灭菌对数值为5.0(即沙门氏菌的杀菌率达到99.999%)的优化杀菌条件为超声时间8.8 min,超声功率300 W;超声温度50 ℃,在该条件下,声热复合杀菌处理后不但对理化性质影响较小,而且还能有效降低原料中乳脂肪球直径,有利于杀菌乳的稳定。

[1]Cregenzán-Alberti O,Halpin R M,Whyte P,et al. Suitability of ccRSM as a tool to predict inactivation and its kinetics forEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandPseudomonasfluorescensinhomogenized milk treated by manothermosonication(MTS)[J].Food Control,2014(39):41-48.

[2]Carrasco E,Morales-Ruela A,Garcia-Gimeno R M. Cross-contamination and recontamination bySalmonellainfoods:A review[J]. Food Research International,2012(45):545-556.

[3]肖杨,张鹏,王辉,等. 超高压处理对生牛乳杀菌效果的研究[J]. 食品科技,2013(05):59-61.

[4]杨洁,豆智华,李冠. 新疆双峰驼乳杀菌条件的选择及其热稳定性[J]. 食品科学,2013(21):36-41.

[5]Surowsky B,Schlüter O,Knorr D. Interactions of Non-Thermal Atmospheric Pressure Plasma with Solid and Liquid Food Systems:A Review[J]. Food Engineering Reviews,2015,7(2):82-108.

[6]Halpin R M,Duffy L,Cregenzán-Alberti O. The effect of non-thermal processing technologies on microbial inactivation:An investigation into sub-lethal injury ofEscherichiacoliandPseudomonasfluorescens[J]. Food Control,2014,41:106-115.

[7]Buckow R,Chandry P S,Ng S Y. Opportunities and challenges in pulsed electric field processing of dairy products[J]. International Dairy Journal,2014,34(2):199-212.

[8]Aschoff J K,Knoblauch K,Hüttner C. Non-Thermal Pasteurization of Orange(Citrussinensis(L.)Osbeck)Juices Using Continuous Pressure Change Technology(PCT):a Proof-of-Concept[J]. Food and Bioprocess Technology,2016,9(10):1681-1691.

[9]Giorgio M,Luca F,Novelli E. Ultrasonic inactivation of microorganisms:A compromise between lethal capacity and sensory quality of milk[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies,2015(29):215-221.

[10]Shengpu G,Yacine H,Gillian D. Inactivation ofEnterobacteraerogenesin reconstituted skim milk by high-and low-frequency ultrasound[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2014(21):2099-2106.

[11]Garcia M L.Effect of heat and ultrasonic waves on the survival of two strains ofBacillussubtilis[J]. Journal of Applied Bacteriology,1989,67:619-628.

[12]E. Evelyn,Filipa V. Thermosonication versus thermal processing of skim milk and beef slurry:Modeling the inactivation kinetics ofpsychrotrophicBacilluscereusspores[J]. Food Research International,2015(67):67-74.

[13]施红英,张静岩,吴卫东,等. 热-超声波联合对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果研究[J].食品工业科技,2015,36(4):89-91,96.

[14]韩晗,李雪敏,韦晓婷,等. 即食牛乳中沙门氏菌生长模型的建立[J].食品科技,2016,41(5):316-322.

[15]宣晓婷,刘东红,丁甜.弱酸性电位水对单增李斯特菌致死机制的研究[J].食品安全质量检测学报,2015,6(1):245-251.

[16]Som N,Sanjeev A,Kasiviswanathan M.Inactivation of thermoduric aerobic sporeformers in milk by ultrasonication[J]. Food Control,2014(37):232-239.

[17]Suguna M,Rajeev B,Wan-N.Influence of temperature variations on growth,injury survival and inactivation of Listeria monocytogenes in goat milk samples at laboratory scale[J]. International Journal of Dairy Technology,2014,67(3):437-445.

[18]唐梦茹,陈涛涛,汪少芸,等. 响应面优化酶解法制备韭菜籽蛋白抗氧化肽工艺[J].中国食品学报,2016,16(4):159-165.

[19]孙琦.牛乳热加工特性及其盐类平衡的研究[D]. 北京:中国农业科学院,2012:49.

[20]赵振峰,张仲欣,张玉先.不同杀菌方法对牛奶中VC损失量的影响研究[J].中国乳业,2006,(2):49-51.

[21]姜雪,于鹏.超高压处理对牛乳理化性质及脂肪酸成分的影响[J].食品工业,2016,37(7):175-177.

[22]闫坤，吕加平，谢跃杰，等. 超声波技术在乳品加工中的应用[J]. 中国乳品工业，2009，37(11)：29-32.

[23]Martínez-Monteagudo S I,GänzleM G,Saldaa M D A. High-pressure and temperature effects on the inactivation of Bacillus amyloliquefaciens,alkaline phosphatase and storage stability of conjugated linoleic acid in milk[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies,2014(26):59-66.

Sterilization effects of thermo-sonication treatment onSalmonella

LIN Yi1,DING Tian1,2,LIU Dong-hong1,2，*,WANG Wen-Jun1

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China；2.Fuli Institute of Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

The new sterilization technologies of high efficiency and low effect on nutritional components have been widely concerned. The reconstituted milk,was inoculated withSalmonella,and sterilization effects of thermos-sonication treatment were studied. The physicochemical parameters of pre-and post-treatment were also analyzed in this study. The results showed that the significance order of factors affecting the killing logarithm value was:ultrasonic temperature,ultrasonic time,and ultrasonic power. Taking 5.0 killing logarithm value(the percentage of killing rate was 99.999% forSalmonella)as reference,the optimal sterilization conditions were:ultrasonic time of 8.8 min,ultrasonic power of 307 W,and ultrasonic temperature of 50 ℃. Under these conditions,the physicochemical parameters did not change obviously,and the diameter of fat globules was reduced remarkably(p<0.05),only 17.86% of pre-treatment sample. Therefore,it indicates that the thermo-sonication technique has huge potential for application as a sterilization method in liquid milk industry.

Salmonella;thermo-sonication;sterilization;response surface method

2016-10-19

林祎(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:21313042@zju.edu.cn。

*通讯作者:刘东红(1968-)，女，博士，教授，研究方向：食品加工技术新装备和工程化设计, E-mail:dhliu@zju.edu.cn。

国家重点研发计划项目课题(2016YFD0400301)；国家自然科学基金(31371872)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0121-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.015