张欢　王春兴

摘要：随着饮用水安全问题日渐突出，快速准确的水质毒性检测技术已经成为研究的热点。提出了一种基于发光细菌法的生物学检测系统，这一系统可以对水质毒性进行快速检测。微弱的荧光丢失在检测中得到了校准，光电检测的效率也得到了提高。实验结果表明本系统检测的可靠性可以达到甚至优于传统方法。

关键词：发光细菌；生物学方法；快速检测；水质毒性；光电检测

中图分类号：TP311 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2017）05-0221-02

Abstract： Nowsdays， the industrial modernization is improving， drinking water safety issues become increasingly prominent. Rapid and accurate water quality toxicity detection technology has become a hot spot. A biological detection system based on luminescent bacteria method is proposed. The system can detect the toxicity of drinking water rapidly. In the detecting， weak fluorescence loss is calibrated， the efficiency of photoelectric detection system is improved. The experimental results show that the reliability of this system can achieve even be better than traditional methods.

Key words： luminescent bacteria； biological method； fast detection； water toxicity； photoelectric detection

1 概述

發光细菌是一类自身能够进行生物发光的细菌，当遇到外界不利环境时，由于生理活动受到影响，细菌内的发光反应被抑制，发光程度也就受到影响。发光受抑制的程度跟有毒物质的毒性大小及其浓度有关，光强的变化可以利用光电检测技术获得，从而判断有害物质的毒性。

为了测试设计系统的性能，检测的样品包括重金属盐，化学农药等，他们都会对发光细菌产生毒性。现有的水质检测技术有理化方法和传统生物评价方法。这些方法需要在实验室进行，大都需要实验仪器，测试结果需要花费24小时甚至更长时间。在这一设计中，首先要对发光细菌冻干粉进行菌种复活，制备好发光细菌试剂，然后，将待测毒物配置成不同浓度的溶液，至少配置两个稀释度，方便对比。本系统采用自动加样单元将参加反应的试剂加入反应池中，这一自动加样单元由主控芯片控制，可以避免人为操作的失误。在实验中，发光细菌冻干粉在复苏后，在正常的生理条件下，会恢复发光。在将各种待测试剂连接到本系统后，自动加样单元会将其加入到反应池中，在充分混合后，发光细菌发出的光强会发生变化，并且随着待测样品浓度增加，发光细菌的发光强度会变弱，通过检测发光强度的变化，对水质进行评估。

2 实验材料和方法

2.1 检测细菌、待测毒物和备用试剂

测试用发光细菌：采用青海弧菌冻干粉，配有复苏液、渗透压调节液，36%的稀盐酸溶液和氢氧化钠溶液用于调节溶液pH。

待测毒物有重金属盐（氯化汞，氯化镉，氯化镍，硝酸铅等），化学农药（杀虫剂敌敌畏），其他物质（氰化钾等）。

2.2 检测原理

科学研究发现，不同发光细菌发光的机理都是由具有特异性的荧光酶（LE）、氧分子（02）、单核苷酸的黄素（FMNH2）、八碳以上的长链脂肪醛（RCHO）所参与的反应，其大致过程如下：

这一发光反应是由氧分子参与，将长链脂肪醛和还原性的黄素单核苷酸（FMNH2）氧化为长链脂肪酸及FMN。反应过程中会发出微弱可见光，需要在黑暗环境中观察。这一发光反应是发光细菌正常的生理代谢，正是利用发光细菌这一特征。在实验前，需要将参加反应的试剂浓度比，反应条件（pH，温度等）调整到最适宜范围，以获得稳定的峰值波长。

2.3 系统设计

在本系统中，采用日本滨松H5773型光电倍增管，Pi-102台式ATP荧光检测仪的测量结果作为参照。采用瑞士ARL3460光谱仪测量光强度。系统的MCU采用AD公司的ADUC834单片机。本系统主要包括以下模块：试剂反应单元，荧光捕获单元，光校准单元和信号调理模块。反应和捕获单元是在一个封闭的容器中进行，荧光捕获部分由光电倍增管捕获荧光，并起着光电转换的作用，光校准单元通过检测荧光衰减的程度对光强进行补偿。

2.3.1 试剂的反应

这一模块实现了自动加样功能，缩短了检测时间。本系统采用欧姆龙继电器G6E实现对加样泵的控制，采用继电器驱动器实现对于继电器的控制。在这一系统中，输送试剂用的管路是低粘性的，这样可以避免输送线路上的损失。如图1所示，待测试剂和细菌溶液反应的容器选用透明玻璃反应池。图1中，a中存放待测有毒试剂，b中存放发光细菌试剂，c是发光细菌与待测毒物反应容器。

2.3.2 光的校准和捕获

发光细菌发出的荧光会被玻璃容器和溶液吸收而减弱，造成检测结果的差异，如图2所示，本系统在光电检测之前添加了校准模块，在反应容器的前侧添加了发光二极管，保证检测到的光强与发光细菌发出的荧光强度一致，校准和捕获过程在密闭容器中进行。

2.3.3 信号调理

信号处理是系统的关键步骤，光电倍增管在完成光电转换之后，得到的是电流信号，电流信号在电路系统中是不方便处理的，需要转换为电压信号，并经过逐级放大才能达到可以处理的范围。信号调理电路如图3所示。

3 结果及讨论

3.1 部分有毒物质的检测实验

首先使用本系统对不同浓度重金屬溶液的毒性进行测试，从实验数据可以得出，有毒试剂毒性与其浓度呈线性关系，可以得到不同重金属（HgCl2， NiCl2，Pb（NO3）2，CdCl2）对发光细菌的半数抑制浓度值EC50。然后用同样的方法，对农药敌敌畏进行检测，同样可以得出其EC50值，氯化镉、硝酸铅溶液与发光细菌发光强度的关系如图4所示。对它们的浓度曲线进行分析，可以得出这几种物质的线性回归方程和相关系数。采用国外水质毒性测试仪Microtox对于铅和镉的检测限分别为24.4mg/L和20.0mg/L，从图中可知，本系统检测结果更优。

3.2 系统降噪

稳定的系统输出是系统性能重要指标之一。PCB电路在系统测试阶段会产生噪声，由于系统检测的是微弱信号，系统噪声过大会对检测结果造成影响，在电路设计中添加了滤波电路，经多次测试，噪声可以被限制到很低的范围，对检测结果的影响可以忽略，对系统末端输出的测量数据如图5所示。

3.3 检测系统的准确性

系统可重复性是系统准确性的重要指标之一，在测试一中，对系统的可重复性进行测试，选择6mg/L的ZnCl2溶液作为测试用试剂，重复10次实验，测试所得数据如表1，变异系数=标准偏差/平均值×100%=2.86%。从数据可以看出，本系统具有较强的稳定性。除了可重复性，系统的准确性还体现在它和传统生物方法的相关性上。在测试二中，在城市中共测试100份样品污染水源，分别使用本系统和传统生物方法进行测试。由图6可以看出，两者具有很好的相关性，相关系数为87%。综上，系统的准确性可以满足测量要求。

4 结论

本系统经过多方测试，可以应用于绝大多数饮用水安全检测中，发光细菌作为一种野生菌，获取成本低，检测效率高。随着研究的深入，这一检测技术必将在未来发挥重要的作用。

参考文献：

[1] Wang C B， Zhang X. Zhuang. A biochemical system of rapidly detecting bacteria based on ATP bioluminescence technology [J]. Eur Food Res Tech，2012（1）：41-46.

[2] 邓辅财，刘树深，刘海玲，等.部分重金属化合物对淡水发光菌的毒性研究[J].生态毒理学报，2007，2（4）：402-408.

[3] 李再兴，尹青，赵俊娜，等.发光细菌法测定水质急性毒性研究进展[J].河北科技大学学报，2014，35（5）：480-486.

[4] 楼霄，张哲海，王国祥.水生生物毒性试验监测水质的标准化问题[J].环境监测管理与技术，1993，5（2）：26-28.

[5] 周文敏，傅德黔，孙宗光.水中优先控制污染物黑名单[J].中国环境监测，1990，6（4）：1-3.

[6] 朱文杰，徐亚同，张秋卓，等.发光细菌法在环境污染物监测中的进展与应用[J].净水技术，2010，29（4）：54-59.