孟梁等

摘 要 结合水相分子印迹和光子晶体技术构建了吗啡分子印迹光子晶体水凝胶传感器，并成功用于生物样品中痕量吗啡的筛查。以吗啡为印迹模板，甲基丙烯酸为单体，乙二醇二甲基丙烯酸甲酯为交联剂，填充至二氧化硅光子晶体模板孔隙中进行共价型分子印迹聚合，在1% HF溶液中除去光子晶体模板，并洗脱印迹模板分子，即可得到具有目标分子传感功能的分子印迹光子晶体水凝胶传感器。此传感器在水相环境中对吗啡分子的识别能力良好，可以在不需要标记的情况下，将目标分子的识别转变为衍射峰的位移，该光学信号通过传感器颜色的变化表现出来，吗啡浓度由10 pg/mL增加到1 μg/mL过程中，衍射峰最大偏移达到38 nm，并且抗干扰能力强，检出限为0.1 μg/L，响应时间为 40 s，可以重复使用。此检测平台不需要对样品进行处理，便可准确、灵敏、快速地检测复杂样品中的目标分析物。

关键词 水相分子印迹； 光子晶体； 化学传感器； 吗啡； 快速检测； 尿样

1 引 言

阿片类毒品是目前世界上使用历史最长、流行范围最广、危害最严重的毒品[1]。吗啡是海洛因、吗啡和可待因的最终代谢物[2，3]。尽管目前检测吗啡的方法很成熟而且灵敏有效[4～9]，但是都需要贵重的大型分析仪器和复杂的样品前处理过程，耗时费力，难以满足大规模样品筛查以及现场快速检测要求。由于缺少高专一性的抗体，快速筛查免疫试剂盒存在易干扰和灵敏度低的缺点[10]。因此，有必要建立一种快速有效、灵敏、专一并且适合现场筛查大量复杂样品中吗啡的方法。

在本研究中，采用水相分子印迹技术构建了吗啡分子印迹光子晶体水凝胶传感器，由于该传感器具有特殊的反蛋白石阵列结构，吗啡分子的识别过程可以引起水凝胶体积的变化，从而引发阵列结构的Bragg衍射位移，使传感器颜色发生改变。该新型化学传感器平台具有高选择性、高灵敏度以及快速响应的特性，并且已经在药物分析[11～14]、环境检测[15]、生物分析[16，17]乃至生物大分子检测[18，19]方面有了实际应用。对影响传感器的识别能力和传感性能的因素进行了优化。考察了水相制备的传感器的传感性能及其分子识别效果，同时对传感器的识别机理和光学响应机理进行了研究。此传感器平台在水相环境中具有良好的相容性，可用于生物样品中的痕量吗啡分子的检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

EI Quanta FEG 650扫描电镜（OR，USA）；General TU19紫外可见分光光度计（北京，中国）；Bruker VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪（Ettlingen，Germany）；Agilent 7890N 气相色谱/5975C质谱联用仪（GCMS，Agilent Technologies，USA）。发射365 nm波长的紫外光灯（FUSI Electric ST3，Japan）。普通数码相机（Nikon D80，Japan）。

吗啡盐酸盐（Morphine hydrochloride）、海洛因盐酸盐（Heroin hydrochloride）、O6单乙酰吗啡盐酸盐（6Monoacetylmorphine hydrochloride）、可待因磷酸盐（Codeine phosphate）、苯丙胺盐酸盐（Amphetamine hydrochloride）和氯胺酮盐酸盐（Ketamine hydrochloride）购于公安部物证鉴定中心（北京）。甲基丙烯酸（Methacrylic acid，MAA）、丙烯酸、丙烯酰胺和其它试剂购于北京化工厂。乙二醇二甲基丙烯酸甲酯（Ethylene glycol dimethylacrylate，EGDMA）和2， 2′偶氮二异丁腈（2，2′Azobisisobutyronitrile，AIBN）购于Alfa Aesar试剂公司（MA，USA）。无水甲醇购于TEDIA Company（OH，USA）。聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethylmethacrylate，PMMA）载玻片（25 mm × 25 mm×1 mm）购于本地供应商。

2.2 吗啡分子印迹光子晶体水凝胶传感器的制备

采用Stber法制备单一粒径的单分散二氧化硅纳米微球，本研究制备的单分散二氧化硅纳米微球的粒径为220 nm。采用蒸发诱导自组装方法制备光子晶体模板。二氧化硅纳米微球以及光子晶体模板具体制备过程参照文献＼[13＼]。

吗啡分子印迹光子晶体水凝胶传感器制备过程：0.025 mmol吗啡（8.04 mg）、0.35 mmol MMA（29.70 μL）与0.05 mmol EGDMA（9.40 μL）超声溶解于50 μL甲醇和30 μL水中，于阴暗处放置12 h。然后加入2 mg 引发剂AIBN，溶解后通入氮气2 min以除去氧气。将一片PMMA玻片盖在光子晶体模板上，用镊子夹住，然后用微量移液器将50 μL的前驱液从玻片的边缘滴入，利用毛细作用力将前驱液吸入玻片之间以及光子晶体的间隙之间，当光子晶体模板由鲜艳的颜色变为透明时，表明溶液已经完全渗入。用夹子将两片玻片夹好放在365 nm紫外灯下光聚合 2 h。然后浸入1% HF中以除去二氧化硅颗粒，并使两片玻片分离，从而在PMMA玻片形成具有反蛋白石结构的分子印迹膜。然后，将其浸入乙酸/乙醇溶液（1∶99，V/V）2 h以洗脱吗啡模板分子，反复洗脱，直到在洗脱液中用GCMS检测不到吗啡分子为止。最后，将得到的分子印迹膜用去离子水冲洗干净后浸泡在磷酸盐缓冲溶液（pH 7.6，10 mmol/L）中使其达到平衡状态，即可进行检测和表征。作为对照实验，采用上述同样过程制备非分子印迹光子晶体水凝胶（NIPHs），只是在前驱液中不加入吗啡分子。

2.3 吗啡分子印迹光子晶体水凝胶的表征

分子印迹光子晶体水凝胶膜的表面形貌使用扫描电镜观测。将空白分子印迹光子晶体水凝胶分别浸入浓度由低到高的待测分子缓冲溶液中，待稳定后用紫外可见分光光度计测试传感器的Bragg衍射峰的位置，同时在日光灯下用数码相机对其拍照。紫外可见分光光度计和红外光谱仪用于识别性能表征以及识别机理研究。如果没有特殊说明，每个数据均取5次平行实验的平均值（下同）。

3 结果与讨论

3.1 最佳合成体系选择

文献＼[20，21＼]报道，在合成吗啡分子印迹时使用MAA作为功能单体。EGDMA是常用的交联剂，由于其具有一定的亲水性，也适合用于水相分子印迹膜的合成。并且也有使用EGDMA作为交联剂联合甲基丙烯酸功能单体合成吗啡分子印迹的文献报道[20，21]。本研究中也证实使用MAA和EGDMA得到了良好的实验结果。

在致孔剂中加入少量水，对生成具有高度多孔交联结构以及较高内表面积的水相分子印迹水凝胶膜具有至关重要的作用，但是分子印迹过程中强极性水的参与可能会干扰氢键的生成并增强疏水作用力。在本研究中，由于吗啡是强极性化合物，其在有机溶剂中的溶解度较低，为此需要增加致孔剂中水的含量，以增加吗啡的溶解度。兼顾分子印迹水凝胶在水相中的识别能力以及吗啡盐酸盐、甲基丙烯酸和EGDMA在前驱液中的溶解性，选择50 μL甲醇与30 μL水的混合溶液作为致孔剂，制备出具有较好柔韧度和理想内表面特性的分子印迹水凝胶。但是此时水的含量已高达37.5%，这对印迹膜的识别能力有一定的影响。

由于致孔剂中含有比例高达37.5%的水以增加吗啡的溶解度，强极性的水可能会干扰氢键的生成，并增强疏水作用力，以阻碍吗啡模板分子与甲基丙烯酸功能单体之间形成稳定的复合物。吗啡分子与甲基丙烯酸之间存在4个强有力的作用位点[10]，因此在上述条件下还有可能制备出有一定识别能力的分子印迹膜。为了减弱水对分子间氢键形成的干扰，而增强吗啡分子与甲基丙烯酸之间的作用力，就要确保有足够多的功能单体参与反应，以抵抗水分子氢键的干扰，建立模板分子与功能单体之间高亲和作用位点并确保结合位点充分形成。经过实验优化，考察模板分子与功能单体的物质的量比（1∶5，1∶7，1∶10，1∶14，1∶17），最终确定二者比例为1∶14。

通常，交联剂和功能单体的最佳合适比依赖于模板分子的大小[22]。本研究中，加入了过量的功能单体，功能单体的分子数量增加会增长功能单体与交联剂之间的链长，因此，为了稳定水凝胶良好的柔韧性，就需要同时增加交联剂链长，以形成稳定的水凝胶网络骨架结构[23，24]。通过实验，考察了功能单体和交联剂以不同比例（3∶1，5∶1，7∶1，10∶1）制备的分子印迹光子晶体水凝胶的传感性能，确定功能单体和交联剂的比例为7∶1。此平衡条件下制备的分子印迹光子晶体水凝胶不但具有强烈的Bragg衍射信号，而且对吗啡分子具有一定的响应能力，从图1a可见，将空白吗啡分子印迹光子晶体水凝胶分别浸入系列浓度（10 pg/mL～1 μg/mL）的吗啡溶液中，随着溶液中吗啡分子浓度增大，Bragg衍射峰的位置也相应产生位移，Bragg衍射峰最大偏移可达到38 nm，具有较高的灵敏度，可以看到表观颜色变化，可用于实际样品中低浓度吗啡的检测。

3.2 吗啡分子印迹光子晶体水凝胶的传感性能评价

合成体系中存在大量水，但制备的分子印迹光子晶体水凝胶同样具有典型的反蛋白石结构，相互联通的大孔结构规则排列，具有非常大的比表面积（图2）。图1a展示了分子印迹光子晶体水凝胶在最佳识别环境下对目标分子的识别传感性能，Bragg衍射峰最大偏移达到38 nm。虽然38 nm的衍射峰位移在反映分子印迹光子晶体水凝胶的表观颜色变化上有些困难，但是只要调控空白分子印迹光子晶体水凝胶的衍射峰位于两种颜色的突跃处附近，那么随着Bragg衍射峰的位移，其表观颜色就容易发生变化，即可凭借肉眼观测。图1b所示，调控空白吗啡分子印迹光子晶体水凝胶在空白磷酸盐缓冲溶液里呈绿色，而后在1 mg/L 吗啡溶液里，其表观颜色从绿色变到橙色。由于非特异性吸附可能会造成衍射峰的微小位移，将吗啡分子引起衍射峰位移3 nm作为系统噪声，采用紫外可见分光光度仪检测传感器移位，则可估算其检出限为0.1 μg/L（S/N=3）。如果仅用裸眼观测，10 μg/L吗啡溶液就能引起传感器裸眼可感知的表观颜色变化。不论是使用紫外可见分光光度仪还是仅用裸眼观测，此传感器的检出限均优于传统仪器分析方法[25，26]。

选择海洛因、O6单乙酰吗啡、可待因、苯丙胺和氯胺酮等物质进行了干扰实验。由于受尺寸、形状和作用点等因素影响，只有吗啡分子能够与分子印迹纳米孔穴重新结合，从而引起水凝胶体积的变化，进而引起晶格参数及Bragg衍射峰的位置也相应发生变化（图3）。在相同的测试条件下，使用非印迹光子晶体水凝胶做对照实验，结果表明，其对吗啡及其它药物均无响应。

由于分子印迹光子晶体水凝胶三维有序大孔相互联通，在比表面积很高的内表面上密布有效识别位点，较低的传质扩散阻力使目标分子能快速到达内表面上的识别位点。另外，目标分子与识别位点之间的亲和力也能加速目标分子的扩散[12]。实验表明，将空白吗啡分子印迹光子晶体水凝胶浸入10 μg/L吗啡溶液中， 仅需40 s即可到达响应平衡（图4a）。在合成吗啡分子印迹光子晶体水凝胶时，同时增加了交联剂EGDMA 和功能单体甲基丙烯酸的量，继而得到了同样具有良好的柔韧性并且稳定的水凝胶网络骨架结构，并采用分子自组装法以非共价键合方式生成分子印迹，因此，吗啡分子印迹光子晶体水凝胶也很容易再生并重复使用。同一个分子印迹光子晶体水凝胶循环使用5次（吗啡溶液的浓度为10 μg/L），衍射峰位移量的标准偏差小于5%，表明其具有良好的可重复利用性（图4b）。

3.3 吗啡分子印迹光子晶体水凝胶的传感机制研究

3.3.1 分子识别机理研究 本研究采用紫外光谱法和红外光谱法对吗啡分子印迹光子晶体水凝胶的分子识别机理进行了研究。从甲基丙烯酸与吗啡相互作用的紫外光谱图（图5）可见，随着甲基丙烯酸量增大，最大吸收峰向长波方向移动，且吸收峰的强度增加。这是由于氢键对生色基团作为质子给予体分子的第一个ππ*吸收带的影响所致；另外，甲基丙烯酸和吗啡分子间的静电作用力也起了一定的作用。同时这也是甲基丙烯酸和吗啡分子间通过氢键和静电作用力自组装形成超分子体系的特征。与吗啡溶液的红外光谱图相比，在甲基丙烯酸和吗啡混合体系的红外光谱图（图6）中，COC对称振动吸收峰947 cm

3.3.3 光学响应机理研究

从Scathcard 分析数据可知，分子印迹光子晶体水凝胶吸附吗啡的量远小于其自身的质量，这表明低浓度的吗啡即可引起水凝胶的膨胀，产生光学响应。由吗啡分子浓度差导致的Donnan势会驱使吗啡分子涌入水凝胶，并填充印迹空穴，随后吗啡分子上的氨基与识别位点上的羧基相互作用使水凝胶内部的离子强度也增大，两个作用共同导致了光子晶体水凝胶晶格结构的膨胀，从而使Bragg衍射峰红移[15，29]。另外，实验中发现在前驱液中尽可能多加入印迹分子的量，以生成更多的分子印迹纳米孔穴，从而提高分子印迹光子晶体水凝胶的识

别效率，提高检测灵敏度[12]。但是由于吗啡分子在前驱液中的溶解度较低，从而导致其内部的分子印迹纳米孔穴的量相对较少，影响分子识别效率。

3.4 吗啡分子印迹光子晶体水凝胶在生物样品中的传感性能

考察了吗啡分子印迹光子晶体水凝胶在真实生物样品（人尿）中的传感性能。吸毒者的尿样来自公安局法医物证鉴定中心（n=3），并采用GCMS分析确认含有吗啡。待检测尿液需要用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.6）以体积比1 ∶ 2稀释。分子印迹光子晶体水凝胶在空白尿液缓冲溶液中无响应，这表明生物样品基质不干扰分子印迹光子晶体水凝胶的识别能力。在吸毒者的尿中，分子印迹光子晶体水凝胶由初始的绿色变成了橙色（图8），结果表明，吗啡分子印迹光子晶体水凝胶在有干扰存在的生物样品中依然保持着高选择性和高灵敏度的响应能力，证明此传感器具有良好的实用性能。

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