徐永明，徐宏光，张晓玲，高智，肖良

（1.皖南医学院第一附属医院弋矶山医院脊柱外科，安徽芜湖241001；2.中国科学院上海生命科学院骨科细胞与分子生物学实验室，上海200025）

miR-125a-5p在大鼠终板软骨细胞自然退变中的表达及其靶基因预测

徐永明1，徐宏光1，张晓玲2，高智1，肖良1

（1.皖南医学院第一附属医院弋矶山医院脊柱外科，安徽芜湖241001；2.中国科学院上海生命科学院骨科细胞与分子生物学实验室，上海200025）

目的：通过建立体外大鼠终板软骨细胞自然退变模型，探讨miR-125a-5p在自然传代诱导大鼠终板软骨细胞退变中的表达，通过生物信息学软件预测相关靶基因.方法：取大鼠原代终板软骨细胞，应用胰酶消化法和自然传代法培养终板软骨细胞，分别选取P2、P5、P8代细胞进行甲苯胺蓝及阿辛蓝染色观察细胞形态改变.qRT-PCR检测终板软骨细胞中miR-125a-5p表达情况，通过生物信息学软件预测相关靶基因.结果：细胞传到P5代时细胞由多角形变成长梭形，外基质分泌减少，细胞形态发生退变改变，qRT-PCR检测结果显示miR-125a-5p表达含量随细胞代数增加逐渐减少.结论：大鼠终板软骨细胞自然传代至P5代出现退变改变，miR-125a-5p与终板软骨退变有密切联系.

miR-125a-5p；终板软骨细胞；软骨退变

随着人口结构老龄化，脊柱退行性疾病发病率不断上升，越来越多人们长期被颈腰痛所折磨，在引起颈腰痛诸多因素中椎间盘退变被视为最为重要因素之一[1].尽管目前在临床中可采取药物、理疗、手术等多种治疗手段，但是临床疗效往往无法令患者达到满意的效果，也无法从根本上去预防和阻止椎间盘退变进一步发展.终板软骨是构成椎间盘一重要结构，是椎间盘营养获得主要途径，终板软骨退变进一步导致椎间盘退变，相反通过保护终板软骨可以有效延缓椎间盘退变的发生[2,3]，因此对终板软骨相关病理生理研究意义十分重要.

MicroRNA（miRNA）是一类内源性表达，非编码小RNA，能通过靶向转录抑制或切割进而起到对mRNA基因表达抑制作用.尽管估计miRNAs在人类基因组只占1%–3%，但是它们取能够在人类中调节大约30%的蛋白编码基因[4].miR-125a-5p作为miRNA家族中一员，目前在脑血管内皮细胞、免疫调节、胰腺肿瘤等方面研究广泛受到人们的关注[5-7]，然而目前其在骨科领域尤其涉及到终板软骨有关研究中报道甚少，本研究旨在揭示miR-125a-5p在终板软骨退变中表达及相关意义.

1 材料与方法

1.1 材料

10只Sprague Dawley（SD）大鼠（160±15g，雌雄不限）购买于上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK（沪）2012-0002］.二型胶原酶（Sigma;美国）；0.25%Trypsin-EDTA溶液、胎牛血清、青-链霉素双抗溶液100×（Gibico;美国）；DMEM/F12培养液（Hyclone;美国）；甲苯胺蓝染色试剂盒、阿辛蓝染色试剂盒（碧云天生物技术研究所;中国）；细胞计数仪、Trizol试剂（Invitrogen;美国）；Realtime PCR试剂盒（takara;大连）；实时逆转录聚合酶链反应仪（RocheLightCycler480;德国）；倒置荧光显微镜（Leica;德国）.

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代终板软骨细胞的获取和培养

10只SD级大鼠按500mg/kg药物量腹腔注射浓度为4%水合氯醛处死，常规消毒后在超净台内取出整段腰椎，用组织剪剔除腰椎附属的肌肉、韧带、软组织，尖刀片分别切取各个节段腰椎间盘组织并用含1%双抗（青霉素-链霉素混合液）的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2-3次，眼科剪再将获得的终板软骨组织剪碎成大小接近1mm3，0.25%Trypsin-EDTA溶液消化30min后加入0.2%II型胶原酶消化6h，将所得悬液过滤2-3次后离心悬液5mi（1000r/min）去除消化液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液吹打均匀并种植于10cm培养皿后放入无菌细胞培养箱内进行培养（37℃含5%CO2），培养液每3天更换一次，细胞融合至大约90%时按1：2传代.

1.2.2 甲苯胺蓝染色

分别将P2、P5、P8代细胞种植在12孔培养皿中，待细胞融合至90%时收集细胞后用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定15min后PBS再次洗涤2次，每孔加入1ml甲苯胺蓝染色60min去除染液后PBS洗涤3次，自然晾干后分别用倒置显微镜下拍照观察细胞改变.

1.2.3 阿辛蓝染色

如1.2.2所述，收集细胞后向12孔培养皿中每孔分别加阿辛蓝染液1ml染色30分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟，自然晾干后分别用倒置显微镜下拍照观察细胞镜改变.

1.2.4 RNA提取及RT-PCR

分别将不同代数的大鼠终板软骨细胞接种至6孔培养皿中，待细胞融合至90%时，用0.25%Trypsin-EDTA溶液消化细胞并离心后分别吸取至1.5ml EP管中，每管中加入0.5ml Trizol在冰上裂解提取RNA，按20μl反转体系反转成cDNA后进行RT-PCR，每个样品均设三个重复孔.设U6为内部参照.反应条件：95℃预变30s；95℃变性5s；60℃退火延伸25s，扩增50个循环.使用Roche LightCycler480软件自动分析结果，计算2-△△Ct值，rno-miR-125a-5p引物由广州锐博生物公司合成.

1.2.5 靶基因预测及Gene Ontology（Go）分析

对miR-125a-5p进行靶基因预测分析时，为了增加靶基因预测结果的可靠性，选取了miranda、mirbase、mirdb等3个数据库进行分析，将3个数据库有关交集的靶基因作为最终预测结果.通过应用David软件对所得到的靶基因进行Go分析，将靶基因按照参与有相关生物学过程进行分类.

1.2.6 统计学处理

实验数据均由SPSS18.0统计软件处理，以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本间t检验，设检验水准为α=0.05，P＜0.05具有统计学意义.

2 结果

2.1 大鼠终板软骨细胞通过体外自然传代发生退变改变

大鼠终板软骨细胞进行体外自然传代至P5代时，细胞形态发生明显改变，由多角形逐渐变成长梭形，细胞排列较紊乱，生长速度减慢，甲苯胺蓝及阿辛蓝染色见细胞外基质分泌减少，细胞发生退变改变（见图1）.

图1 P2、P5、P8代大鼠终板软骨细胞阿辛蓝和甲苯胺蓝染色（×100倍）

2.2 miR-125a-5p在大鼠终板软骨细胞中表达

qRT-PCR结果显示miR-125a-5p表达在大鼠终板软骨细胞中随着细胞代数增大呈逐渐减少趋势，miR-125a-5p与软骨细胞退变存在密切联系（见图2）.

图2 大鼠不同代数终板软骨细胞与原代比较miR-125a-5p表达情况（*表示P＜0.05；**表示P＜0.01）

2.3 miR-125a-5p相关靶基因预测

通过3种不同生物软件预测miR-125a-5p靶基因有1334个，其中3种软件共同涉及到的靶基因有8个，有2种软件共同涉及到的靶基因有112个，部分靶基因列出见表1、图3.

表1 分别通过miranda、mirbase、mirdb3种生物信息软件预测rno-miR-125a-5p可能结合的靶基因

图3 miranda、mirbase、mirdb 3个生物信息软件预测miR-125a-5p有关靶基因韦恩图

2.4 miR-125a-5p相关Go（Gene Ontology）分析

通过Go分析结果发现miR-125a-5p主要通过参生物学过程、细胞组成及分子功能3大方面进行相应靶基因的调控（见图4）.

图4 David软件进行miR-125a-5p有关Go分析

3 讨论

当今社会中腰腿痛不断的影响着人类健康，椎间盘退变是引起腰痛的诸多病因中最常见原因之一.终板软骨是构成椎间盘重要组成部分，其主要由终板软骨细胞、细胞外基质、二型胶原组成.对人日常活动过程中所产生的不同力学刺激具有重要调节功能，椎间盘获取营养途径主要来源终板软骨，终板软骨的退变进而引起椎间盘退变.研究通过保护终板软骨可有效缓解椎间盘退变[2].通过对终板软骨的研究对明确椎间盘退变有着重要意义.

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，在1993年第一个miRNA被Lee等人发现[8].在不同物种中miRNA具有高度保守性，越来越多的miRNA被鉴定和研究在人类、动物、植物以及病毒中，到目前大约超过2000多个miRNAs在人类中被发现.目前发现的microRNA主要依赖与靶基因mRNA3’-UTR不完全互补及完全互补进而影响靶基因mRNA的稳定性.对维系组织或器官系统的正常发育等方面有着重要作用.

目前miRNA与椎间盘退变相关研究渐有报道，胡凯等[9]发现在人退变椎间盘髓核组织中miR-663b表达水平明显降低.miR-663b通过负向调控matrix metallopeptidase2（MMP-2）最终导致MMP-2在退变椎间盘组织中明显增多.同时陈宇飞等[10]发现miR-129-5p表达在退变椎间盘髓核组织中显著下调，并且通过生物信息学方法预测miR-129-5p的靶基因为Ⅰ型胶原基因和整合素α1基因，从而引起细胞功能学的改变.并在小鼠体内通过过表达miR-129-5p可明显抑制Ⅰ型胶原基因和整合素α1基因，从而抑制椎间盘中蛋白Ⅰ型胶原和整合素α1的合成，相反抑制miR-129-5p可上调Ⅰ型胶原基因和整合素α1基因，进而对椎间盘退变起调控作用.

前期我们通过生物学芯片发现miR-125a-5p在腰椎退变的人终板软骨中明显比正常人椎间盘表达量低，并在人终板软骨细胞体外得以验证.本实验中通过自然传代诱导大鼠终板软骨细胞退变，qRT-PCR结果表明miR-125a-5p在自然传代诱导终板软骨细胞退变随细胞代数增多表达量逐渐减低，间接证实miR-125a-5p可能参与软骨退变过程，并通过多种靶基因预测软件发现Galnt14、Gcnt1、Itga7、Pipox、Prim2、Rhot2、Slc35a4、Sstr3最为有可能的靶基因，同时Go分析提示其参与多个生物学过程中的调控.因此我们希望通过进一步研究明确miR-125a-5p在椎间盘退变中调控的相关靶基因，阐明其在椎间盘退变中有关作用，目前miRNA作为椎间盘退变新的治疗靶点，望今后在治疗椎间盘退变等相关疾病带来了新的曙光.

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〔10〕陈宇飞.m iR-129-5p在椎间盘退变中的作用及其表观遗传调控研究[D].第四军医大学,2014.

R-332

：A

：1673-260X（2017）03-0039-03

2016-11-10

国家自然科学基金（81572185）

徐宏光，男，博士研究生，教授，博士生导师，研究方向：脊柱外科与老年骨病