李 健综述，曾小平审校

(1、南昌大学基础医学院免疫学教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民医院检验科，江西宜春336000)

HBV逆转录酶区基因耐药变异的研究现状

李 健1，2综述，曾小平1审校

(1、南昌大学基础医学院免疫学教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民医院检验科，江西宜春336000)

乙型肝炎病毒是最容易产生基因变异的病毒之一，不仅自然变异率较高，而且抗病毒药物和免疫因素可诱导其产生适应性变异。乙型肝炎病毒逆转录酶区的基因变异可导致其对核苷（酸）类似物产生耐药性。检测乙型肝炎病毒逆转录酶区基因变异不但可以发现和研究新的耐药变异位点，还可为临床治疗乙肝患者时选择合适抗病毒药物、耐药监测、预后提供参考。但不同的检测方法有各自的特点，可根据实际情况选择合适的方法运用于临床实践或科学研究。

乙型肝炎病毒；HBV逆转录酶区；核苷（酸）类似物；耐药变异

我国是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染高流行区域[1]，一般人群HBV表面抗原（HB-sAg）的携带率为7.18%；慢性HBV感染者约9300万人，慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年死于HBV感染所致疾病50余万人[2，3]。目前抗HBV药物除干扰素外，另一类为核苷（酸）类似物（nucleoside analogues，NAs），主要包括：拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韦酯（Adefovirdipivoxil，ADV）、恩替卡韦（Entecavir，ENV）、替比夫定（Telbivudine，LdT）等。NAs其进入机体后，形成三磷酸活性成分与机体天然的脱氧三磷酸核苷（dNTP）竞争结合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA链合成终止，这是核苷（酸）类似物抑制HBV复制的机制[4]。NAs抗病毒疗效显著、副作用少、价格经济，因而广泛应用于临床乙型病毒性肝炎抗病毒治疗，但随着用药人群基数增大和用药时间延长其耐药问题逐渐凸显。本文就HBV逆转录酶区基因变异与NAs耐药的耐药机制、变异位点、变异模式、耐药变异的检测等做一综述。

1 HBV逆转录酶区基因变异导致核苷（酸）类似物耐药的机制

乙型肝炎病毒发生基因变异特别是HBV逆转录酶区（也可称P区、聚合酶区）的基因变异，导致产生的HBV聚合酶与核苷（酸）类似物结合力降低，那么变异的HBV即不受核苷（酸）类似物的抑制或抑制能力下降，因此，在继续应用核苷（酸）类似物治疗的情况下，野生株病毒因对核苷（酸）类似物敏感而继续被抑制，变异株病毒因具备一定的复制能力，而且对核苷（酸）类似物不敏感而逐渐代替野生株，成为体内的优势株，从而导致患者对于核苷（酸）类似物的耐药[4]。耐药变异的产生一方面是在分子结构上产生了影响HBV聚合酶表达的基因变异；另一方面耐药变异株和野生株的共生生态的变化，耐药变异株要能够持续的复制增殖达到一定的数量水平成为所谓的优势株，并表现出耐药的临床表现。然而目前并没有足够的研究明确优势株在准种池的比例，再者不同的HBV基因变异检测方法能检出的变异株的敏感性也存在明显的差异[5，6]，需要进一步研究HBV基因变异的未知位点和变异模式、变异株的拷贝数、变异株在准种池内的比例与耐药的关系[7]。

1.1 HBV逆转录酶区基因变异的类型

1.1.1 自然变异乙肝病毒基因组（HBV-DNA）含有3200个核苷酸，其中HBV逆转录酶区有344个核苷酸，据统计HBV核苷酸错配率约为10-5左右，HBV每天约可产生至少1012个病毒[8]，那么HBV逆转录酶区就可产生109的碱基错配，如此高的自然变异是耐药变异的基础[9]。

1.1.2 选择压力下的适应变异HBV有很高的自然变异，变异随着病毒不断增殖而积累，在免疫因素和抗病毒药物施加的选择压力下，不能适应选择压力的变异被抑制，能适应这些选择压力的变异株就有可能成为优势株而导致耐药的产生。

1.2 抗病毒药物的效果影响耐药变异株的产生HBV变异的积累依赖于乙肝病毒超强的复制和增殖，如果抗HBV药物有很强的抗病毒能力而迅速抑制了病毒的复制，耐药变异就很难产生。如果抗HBV药物抗病毒能力很弱，就无法对病毒形成选择压力，那么适应药物的耐药变异也很难被筛选出来。中等抗病毒效果的药物治疗下既能形成选择压力又不能完全抑制病毒复制，最有利于耐药变异株的产生。

1.3 影响HBV逆转录酶区基因耐药变异的其它因素基因屏障是控制出现表型耐药的耐药基因变异的位点数目。高基因屏障药物需要病毒出现多个位点的基因变异才可能出现耐药，因而高基因屏障的耐药率低，抗病毒药物联合用药可以提高基因屏障[10]。HBV的复制空间是指肝脏中更新的肝细胞为cccDNA或新的复制模板提供的空间。正常肝细胞更新较慢，但肝脏在严重的炎症损伤下肝细胞更新很快，耐药变异株可以利用这些变异空间进行大量复制。另外影响乙肝患者临床抗病毒药物治疗效果相关的因素如用药史、依从性、遗传、年龄等也间接与耐药变异相关[11，12]。

2 HBV逆转录酶区常见NAs耐药变异位点和变异模式

2.1 耐药变异位点HBV逆转录酶区长度为344个氨基酸残基，N端第1个氨基酸E(谷氨酸)为起点，以rt1－rt344来命名。目前已发现的HBV逆转录酶区耐药变异位点有：L80V/I、V84M、S85A、L108M、L164V、I169T、V173L/M/I、L180M、A181T/V /S、T184G/A/I/S/M、L187I、I190V、A194N/T、V198L、A200V、S202I/G、M204V/L/S、L/M/V207I、S213T、Q214 A/E、Q215s、L217R、S219A、F221Y、rtA222T、A223S、L229V/W、I233V、1、N234T、N236T、N238H、M250V、S256C/G、T259A、D263E、L267Q、L269I、Q271E、P28 lL[13，14]。不同种类NAs耐药与HBV逆转录酶区相关变异位点不尽相同。拉米夫定耐药相关变异位点主要有rtM204I/V/S、rtL180M、rtV173L/M/I、rtL180M、rtA181T/V/S、rtI169T、rtQ215S等，以rtM204I/V最常见；阿德福韦酯耐药相关变异位点主要有：rtN236T、rtA181S/T/V；恩替卡韦耐药相关变异位点为rtI169T、rtL180M、rtT184S/A/I/L/F/G、rtS202I/G、rtM 204V、rtM250V，以rtTl84G/S/A/C位点变异常见；替比夫定耐药变异有rtM204I、rtAl94T等[13－21]。

2.2 耐药变异模式与拉米夫定耐药相关常见的耐药模式有rtM204I/V、rtM204V＋rtL180M、rtM204V＋rtL180M＋rtV173L[17，18]，拉米夫定耐药相关突变中，rtM204V通常伴随rtL180M，rtM204I多单独出现[17]；阿德福韦酯耐药相关常见的耐药模式有rtA181T/V、rtN236T、rtA181T/V+rtN236T。NAs序贯治疗容易发生基因耐药变异且易发生多位点变异。检测出多位点组合变异模式，往往提示可能出现多种NAs耐药，如出现rtAl8lT/V+rtM204V/I变异模式，可导致对拉米夫定和阿德福韦酯均耐药；当恩替卡韦与拉米夫定、阿德福韦酯存在交叉耐药，变异模式有rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+rtM204V/I，rtLl80M+rtS202G/I+rtM204V/I，rtLl80M+rtM204V/I+ rtM250V，rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+rtM204V/I+ rtM250V，rtVl73L+rtM204V/I+rtM250V，rtVl73L+ rtLl80M+rtTl84G/S/A/C，rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+ rtS202G/I+rtM204V/I，rtAl8lT/V+rtTl84G/S/A/C等[13－21]。

3 HBV逆转录酶区耐药基因变异的检测方法

3.1 运用DNA测序原理的检测方法

3.1.1 直接测序法该方法对HBV全基因组测序，既可对已知的耐药变异位点进行检测，也可对未知的耐药变异进行检测研究。临床上以检测常见耐药变异位点为主。本方法缺点是敏感性低，要求样本的病毒载量＞104拷贝/ml且占总准种池≥20%的病毒变异株，因而不适用于早期检测出耐药变异的发生。有研究在直接测序基础上发展克隆测序法，即通过克隆后再测序以克服直接测序法敏感性低的缺点，但分析大量的克隆样本耗时费力且对技术要求高，不适合临床筛查。有报道利用巢式PCR技术，提高直接测序法检测的敏感性，在病毒载量只有500拷贝/ml的样本检测到了耐药变异并且可以检测到占准种池10%的耐药株[22]。

3.1.2 焦磷酸测序法该方法的检测通量比直接测序法高约100倍，可以对HBV基因组上的任意片段进行测序，在同时检测多个已知的耐药变异同时也可以检测未知的耐药变异。焦磷酸测序法不需要标记引物、核苷酸和凝胶电泳，具有高灵敏、高特异性和准确性等特点，能早期检测核苷(酸)类似物治疗患者的HBV逆转录酶区基因耐药突变异，适用于慢性乙肝患者核苷(酸)类似物的治疗监测，是目前已知的检测HBV耐药相关变异敏感性较高的方法[23]。

3.2 运用杂交原理的检测方法

3.2.1 线性探针技术将特异的寡核苷酸探针固定于硝酸纤维素膜条上对生物素化PCR扩增的目标片段进行反向杂交后显色，使检测结果肉眼可见。本法对检测样本病毒载量的要求与直接测序法相近但检测敏感性更高[24]。可检测病毒载量＞104拷贝/ml且占总准种池≥5%的病毒变异株[25]，因而本方法适用于临床上早期发现耐药变异的出现。但本方法受探针的局限，只能检测常见的几种变异位点，不能用于检测和研究未知的耐药变异[26]。

3.2.2 荧光实时定量PCR该方法结合了PCR技术和FRET核酸定量检测技术。在DNA扩增的同时释放可供检测的荧光信号，实现对模板DNA的定量分析。该方法应用于单核苷酸多态性分析，检测的敏感性高，对血清样本病毒载量要求较低。此法敏感性较高，可同时检测多个耐药变异位点。有报道表明本法可检测当病毒载量＞105拷贝/ml时占总准种池≥1%的病毒变异株[27]，然而已知耐药位点不断增加，该法难已满足临床检测的需要。

3.2.3 基因芯片法该方法在芯片表面有序地固定高密度的寡核苷酸或特定基因片段探针，再与生物素标记的待检基因片段反应，然后通过显色产生荧光信号，软件处理信号获得待测基因序列信息。该法具有高通量，操作简单的特点，但价格高[28]。尚未广泛运用于临床，如能进一步降低成本，该法有极大的临床应用前景。

3.3 表型耐药检测表型耐药检测是指在体外细胞培养系统中使HBV基因组中一个或多个位点突变，再检测病毒对药物的敏感性降低或丧失，可作为耐药诊断的依据[29]。已发展多种技术如瞬时转染细胞模型（transient transfection）、稳定转染细胞模型（stable cell lines)、酶活性分析（enzymatic assay）等用于检测表型耐药。该技术在阐明耐药机制、动态性耐药监测、发现耐药变异、筛选新型抗病毒药物等方面都具有广阔的前景。目前该技术逐渐从科学研究应用于临床耐药分析。

4 小结

目前，临床已广泛使用核苷（酸）类似物治疗HBV感染，但具有极高变异能力的HBV的耐药问题已逐渐凸显[30]，甚至出现针对多种核苷（酸）类似物的耐药性。耐药的产生往往导致抗乙肝病毒治疗的失败，进而引起乙肝患者病情的反跳。适应药物压力的HBV逆转录酶区耐药变异、核苷（酸）类似物抗病毒效果、基因屏障、HBV复制空间和一些宿主因素的共同作用导致了核苷（酸）类似物耐药的产生。多种检测方法可用于HBV逆转录酶区耐药变异的变异位点、变异模式和表型耐药检测，并结合临床以早期评估核苷（酸）类似物耐药的产生、耐药监测，为指导临床合理选择药物、用药方案和耐药产生后药物调整提供依据[31]。临床仍需要更多研究来发现新的变异位点和进一步明确耐药变异与临床诊断、选择抗病毒药物、病情变化的关系。不同的检测方法有各自的优点及局限性，还需要进一步研究高性价比、高通量、高敏感性特异性、操作简单的筛检HBV逆转录酶区耐药变异的检测方法。

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A

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2016-07-18；

2016-12-21)

李健，1983年生，学士学位，主管检验师，南昌大学基础医学院免疫学教研室同等学历申请硕士学位研究生；研究方向：乙肝病毒基因耐药变异。

曾小平，1973年生，副教授，硕士生导师。