余建林，彭 琳，陈娟娟，谭立明

(1、南昌大学公共卫生学院检验专业2011级；2、南昌大学第二临床学院临床医学专业2012级；3、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

·综述·

结核病临床免疫学诊断的研究进展

余建林1，彭 琳2，陈娟娟3，谭立明3

(1、南昌大学公共卫生学院检验专业2011级；2、南昌大学第二临床学院临床医学专业2012级；3、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

结核病是由胞内寄生结核分枝杆菌（MTB）感染人体后引起的疾病。从被认识到现在近200年，结核病的诊断方法多种多样，由于MTB的生长特性，临床症状的非特异性，肺组织的病理变化多样性，结核病的潜伏感染（LTBI）等因素，导致目前很难做到早期、特异、敏感的诊断。本文通过对结核病的免疫诊断的研究作一综述，希望有助于早期、特异、敏感地诊断结核病。

结核病；免疫学诊断；分枝杆菌

目前结核病的诊断方法有多种，但是都存在一定的缺陷：⑴痰培养是结核病诊断的金标准，但是培养周期长，一般需要2~4周才能看到阳性结果，而确定阴性结果需要8周的时间，培养成功率只有80%左右。⑵痰涂片方法虽然简单易行，但是阳性率低，容易造成漏检，有40%以上的成人肺结核及75%肺外结核患者的临床涂片标本检查为阴性，对于潜伏感染无法做出诊断。⑶结核菌素（PPD）试验简便易行，但结核菌素含有多种蛋白质成分，与多种分枝杆菌存在交叉反应，而且需要3天后才能观察结果。结核菌素试验阴性的人群在接种卡介苗后，PPD结果会转为阳性；并且PPD含有多种抗原，可以是多种分枝杆菌所共有，可与其他分枝杆菌发生交叉反应[1，2]，中国人群普遍接种卡介苗，导致其假阳性率增加，且其结果是根据结核结节的大小来判断阳性结果，容易受主观因素的影响。对于免疫力低下的儿童、老年人或者感染能造成免疫缺陷的病毒如HIV的患者，容易造成假阴性。⑷PCR和核酸杂交方法虽然灵敏性较高，但是程序复杂需要专业的操作人员，高灵敏性导致容易出现假阳性。且仪器设备费用高限制了其在临床的应用。⑸酶联免疫斑点测定结核分枝杆菌（ELISPOT-TB）检测技术可以早期特异性检测致病性结核分枝杆菌特异T淋巴细胞，但是需要分离培养外周血单核细胞（PBMC）。对于免疫力低下，或者合并HIV感染及T淋巴细胞减少等无法准确的诊断，且无法区分活动性结核病和结核杆菌潜伏感染（LTBI）。⑹血清学抗体免疫检验技术简便，快速，又有较高的敏感性和特异性，对结核病的诊断与鉴别具有重要的意义，但是由于人体血清中的抗体为多克隆抗体，可存在较严重的交叉反应，导致假阳性率较高。⑺血清抗原检测技术能够实现早期检测，且技术简便快捷，虽然高特异度的抗体较难获得，到那时基因操作技术、蛋白质组学技术及单克隆抗体制备技术，使得高特异性的抗体制备成为可能。

结核分枝杆菌的免疫检测主要包括皮肤菌素试验，结核抗体的检测，结核抗原的检测，细胞因子的检测等。

1 皮肤菌素试验

此方法应用纯蛋白衍生物（PPD）注射到体内，观察其是否会导致人体迟发型超敏反应，来判定人体对MTB有无免疫力，从而判断受试者是否曾经感染过MTB。结核菌素试验（TST）对于诊断活动性结核病的敏感度31.6%，特异度为81.0%[3]。我国人群普遍接种了卡介苗，试验的假阳性率高，也降低了其检测的特异度。结果由人观察结节直径的大小来判断，存在着主观性，容易造成漏诊误诊。免疫力低下，免疫力缺陷或HIV感染者均可以影响该试验的敏感性。TST阳性的结果只能说明曾经感染过MTB或接种过卡介苗，不能说明现在是否感染或者患有结核病，需要进一步的检测才能得出更准确的结果。所以结核菌素试验的临床应用价值不大。

2 结核抗体的检测

结核抗体的检测原理是抗原抗体反应，利用MTB的特异性抗原检测体内相应的抗体，根据检测抗体的滴度来判断人体是否感染MTB。

肺结核患者的体液免疫与抗体IgG、IgM、IgA有关，在结核患者体内能检测特异性的结核抗体。PPD、脂阿拉伯甘露糖（LAM）、重组抗原（38kD蛋白、Ag85复合物、A60抗原等）等可作为抗原检测抗体。活动性结核病患者细胞免疫受损，体液免疫亢进，血清及其他体液中结核抗体升高，随着治疗时间的延长，血清抗体水平逐渐降低，结核抗体的检测，可用于活动性结核病与LTBI鉴别诊断及疗效判断。据报道LAM-IgG、38kD、BCG-IgG、PPDIgG检测的敏感度分别是74.5%、70.9%、80.0%和83.6%；特异度分别是91.0%、99.0%、93.0%和84.0%；ELISA法测定血清结核抗体的线性范围是0.625~5μg/ml，阴性与阳性标本重复率分别是100%、95%，特异性为96%[4]。人体血液中抗体为多克隆抗体，用结核抗原去检测时会出现交叉反应；在刚刚治愈的结核病患者体内含有较高浓度的结核抗体等会造成假阳性。重症肺结核、血播散型结核病、老年患者或HIV感染者等免疫力低下，体内的MTB抗原无法刺激机体产生足量的结核抗体，导致敏感性较低，甚至出现假阴性结果。

3 结核抗原的检测

结核抗原的检测原理是抗原抗体反应的特异性，利用单克隆抗体来检测体内的MTB抗原，从而判断机体是否感染MTB。

MTB的特异性蛋白抗原如L-丙氨酸脱氢酶、异丙基苹果酸合酶、烟碱核苷磷酸酯酶，MPT64和两个假定保守蛋白能渗透至人的胸腔积液、腹水、痰液等体液中，有助于肺外结核的诊断。MPT64抗原是结核分枝杆菌分泌时间最早、量最多，且非结核分枝杆菌不分泌[5]；且MPT64抗原检测的敏感度，特异度分别是64.4%、99.4%[6，7]。Martin A[8]发现与聚合酶链反应相比，MPT64检测的敏感度和特异度分别为96.5%和100%，两者的一致性达96.9%。对仪器系统法报告为阳性者，培养滤液MPT64抗原检测法阳性率为93.62%[9]。不同方法检测同一种抗原，同一种方法检测不同抗原，相同抗原不同组合测定的结果敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均有不同[10，11]。检测脑脊液早期分泌的抗原-6（ESAT-6）与培养基滤过蛋白-10（CFP-10）抗原敏感度分别为73.33%、86.67%，特异度为90.00%、95.00%[12]。应用免疫荧光细胞化学染色法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6，其敏感性为90.48%，特异性为91.49%[13]。由前所述可知应用检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌相比于CFP-10、ESAT-6敏感度高，特异度强，具有良好的临床应用前景。结核分枝杆菌抗原结合化学发光定量的检测方法，可用于结核病的早期辅助诊断[14]。

结核抗原的检测可以作为MTB存在的直接证据，可避免因为机体免疫应答低下，导致抗体检测或者细胞检测假阴性。

4 细胞因子的检测

结核免疫以细胞免疫为主，巨噬细胞在控制、杀灭MTB中起到重要作用，其抗菌活性受到多种细胞因子(CK)的调节。Th1型细胞因子能激活单核巨噬细胞，增强巨噬细胞的抗菌能力，对MTB感染起到保护性免疫应答作用，有利于疾病的控制。Th2型细胞因子抑制细胞免疫，降低了巨噬细胞的抗菌能力，使结核病的免疫应答减弱，促进了疾病的发展。目前认为IFN-γ、IL-12是促进Th1分化的主要因子；IL-4、IL-10是促进Th2细胞分化的主要因子。巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后，产生一系列的细胞因子谱系：IL-1、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）和IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-4。结核肉芽肿形成是一个复杂的细胞因子效应过程，参与的细胞因子有IL-1、IL-8、IL-12、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-I）、促黑激素释放抑制因子（MIF）、TGF-β、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、生长因子集落刺激因子（GF-CSF）等[15]。特异性T细胞被激活增殖分泌的IFN-γ在细胞免疫中起着重要的作用，可以将巨噬细胞激活为吞噬细胞并破坏细菌[16]。IL-21能够增强CD8T细胞，促进肺部T细胞聚集，增强T细胞的细胞因子的产生[17]。

细胞因子的检测方法有多种，如γ-干扰素释放试验（IGRAs）是以结核分枝杆菌H37Rv基因RD1区编码抗原ESAT-6和CFP-10肽段为刺激原，体外检测致敏T淋巴细胞分泌的γ-干扰素，I-GRAs能够准确的判断潜伏性的结核感染，特异度和灵敏度明显高于胶体金法(TB-Ab)、痰涂片抗酸染色镜检及聚合酶链式反应(TB-PCR)检测，不受卡介苗的影响，对肺内外检测具有同样的准确度[1，18-21]；T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)具有较高的敏感度和特异度[19，22-24]，以ESAT-6和CFP-10肽段为刺激原，刺激结核感染者外周血单核细胞中存在特异的活化T淋巴细胞分泌IFN-γ，进而应用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）方法检测对MTB反应的效应T细胞数量，对结核感染进行诊断。IGRAs检测敏感性90.9%，特异性为88.5%；T-SPOT.TB检测敏感性93.2%，特异性为92.3%[25]。结核分枝杆菌培养滤液（CF）组分存在PPD、Rv1818c、Rv3812、Rv3018c或合成肽[26]。RD1抗原促进IFN-γ的释放[27]，且在活动性结核与LTBI血浆中有显著差异[28]，同时血液中的IFN-γ和IL-2浓度随着治疗的时间延长及病情的康复逐步地升高[29]。故IFN-γ在结核病的诊断中具有很好的应用前景，然而研究证实体外干扰素γ释放试验，不能用于LTBI较高的地区的活动性结核病的鉴别诊断[30]。

5 结语

影响LTBI传染的因素主要是遗传基因、机体免疫系统、周围环境、影响机体免疫力的疾病等。痰阳性的活动性肺结核患者是主要的传染源，但是LTBI是结核分枝杆菌的潜在载体，LTBI在感染后的一段时间内，由于机体的免疫力发生变化而发展为活动性肺结核。HIV感染、化学治疗、类固醇激素的治疗等，导致LTBI更容易发展为活动性的肺结核[27，31，32]。

在结核病的防治中，重要的任务是活动性肺结核和LTBI的诊断、治疗同步进行。需要具有特异的诊断方法能够鉴别活动性肺结核、LTBI、卡介苗的接种。

目前结核病的检测存在一些问题：IFN-γ不适用于判断结核病的严重程度或疾病进展情况，阳性对照结果有时不会出现，IFN-γ对活动性结核病灵敏度不佳，特别是在感染HIV病毒的患者，阴性结果不能排除活动性结核病。干扰素释放实验不能区分LTBI和活动性结核病[33]，其可能的原因是：抗原的免疫原性不强，不能够刺激细胞产生足够的IFN-γ；细胞对于免疫原不够敏感，需要其他的细胞因子加强细胞的敏感性和活性增加IFN-γ的释放量。

为提高MTB的检出率，可从以下几方面进行改进，如原理不同的几种试验方法的联合使用，抗原的免疫原性的提高，细胞因子和蛋白抗原联合检测等方面。免疫磁珠捕获联合双内标聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验定量检测结核杆菌技术（IMC-PCR-ELISA）特异度和敏感度均很高[34]。IFN-γ和IL-10可促进结核分枝杆菌肽的MHC-II复合物形成[35]，在检测IFN-γ的同时，可以检测其他的细胞因子如IL-2[35]，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，可提高检测的敏感度和特异性，同时也可以鉴别出活动性结核病和LTBI。在检测结核分枝杆菌抗原如MPT64[6]、ESAT-6与CFP-10[12]等，可以结合IFN-γ的检测。对于IGRAs阳性结果不明显的现象，可以加入一些具有协同作用的细胞因子如B7与CD28或者选择其他的刺激原来提高IFN-γ的释放。

提高MTB检测的敏感性可以从以下几个方面：⑴标本的选择，如脑脊液因为蛋白质类的物质相对比较少，交叉反应或者干扰物质较少，使得其检测结果的敏感度和特异度均较高；而在血清中因为抗体或者其他的物质相对较多，存在的干扰较严重；⑵检测方法的选择，例如MPT64的检测，不同的检测方法具有不同的灵敏度和特异度[6，8，10]，敏感性不好，可能是方法选择得欠佳；⑶抗体的选择，可以选择高特异性、高纯度的抗体；⑷标本的处理，恰当的标本处理方法可以减少干扰物质，如使用层析或者差速离心等方法选择合适分子量的物质进行检验。

综上所述，结核病的免疫学诊断方法具有敏感性高，特异性强，方法简便、快速、准确等特点，但目前也有不足之处，笔者认为可以从前面所述的改进方法来提高免疫学诊断的灵敏度和特异度，使其能够更好地为临床诊断和治疗服务

[1]李兵，陈献雄，杨倩婷，等.卡介苗对结核分枝杆菌IFN-γ酶联免疫斑点检测法的影响[J].临床肺科杂志，2010(07)：955-957.

[2]何绿茵，叶惠芬，杨银梅，等.多种实验室检查方法在结核病诊断中的价值[J].实验与检验医学，2009，27(1)：104，107.

[3]何苗，T-SPOT.TB及传统试验诊断活动性结核病的临床评价比较[D].中南大学，2012：16.

[4]张民军，周助权，沈荣柴，等.4种靶特异性抗体检测对肺结核的临床诊断价值[J].皖南医学院学报，2009，36(3)：187-189.

[5]辛茶香，张周云，熊国亮.分枝杆菌菌种鉴定方法及其进展[J].实验与检验医学，2016(1)：1-3，7.

[6]Zhu C，Liu J，Ling Y，et al.Evaluation of the clinical value ofELISA based on MPT64 antibody aptamer for serological diagnosis of pulmonary tuberculosis[J].BMC Infect Dis，2012(12)：96.

[7]李国利，赵铭，张灵霞，等.免疫层析法检测MPT64蛋白在结核与非结核分枝杆菌鉴定中的临床应用价值[J].中国医药导报，2012(31)：152-153.

[8]Martin A，Bombeeck D，Mulders W，et al.Evaluation of the TB Ag MPT64 Rapid test for the identification of Mycobacterium tuberculosis complex[J].Int J Tuberc Lung Dis，2011，15(5)：703-705.

[9]许婉华，黄业伦，刘燕文，等.培养滤液MPT64抗原检测结核分枝杆菌复合群生长的效能分析[J].中国防痨杂志，2012(08).

[10]吴雪琼，张俊仙，李洪敏，等.结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用[J].中国防痨杂志，2001(02).

[11]邓志高.重组结核分枝杆菌ESAT6和CFP10混合抗原及融合抗原诊断结核病的研究[D].湖南师范大学，2013.

[12]张亚杰.ESAT-6与CFP-10在结核性脑膜炎患者的脑脊液中的表达[D].河北医科大学，2012.

[13]聂恒，吴利先.结核分枝杆菌特异性蛋白抗原研究进展及其应用策略探讨[J].中国病原生物学杂志，2014(02).

[14]孟闯.结核分枝杆菌抗原蛋白的表达、免疫特性分析及在牛结核病检测中的初步应用[D].扬州大学，2011：72.

[15]朱晓燕，陈慧，徐俊驰，等.肺结核患者外周血sIL-2R、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的检测意义[J].临床肺科杂志，2015(09)：1564-1566.

[16]吴媛媛，李龙，沈萍萍.巨噬细胞替代激活及调控[J].中国细胞生物学学报，2011(02)：197-203.

[17]Booty MG，Barreira-Silva P，Carpenter SM，et al.IL-21 signaling is essential for optimal host resistance against Mycobacterium tuberculosis infection[J].Sci Rep，2016，6：36720.

[18]Diel R，Loddenkemper R，Meywald-Walter K，et al.Comparative performance of tuberculin skin test，QuantiFERON-TB-Gold In Tube assay，and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis[J].Chest，2009，135(4)：1010-1018.

[19]汪金云，周东枝，徐亚丽.体外释放酶免疫技术检测结核分枝杆菌的临床应用[J].现代实用医学，2016(01)：32-33.

[20]黄华，陈心春，杨倩婷，等.结核分枝杆菌IFN-γ酶联免疫斑点检测在结核诊断中的应用[J].江西医学院学报，2009(04)：57-59. [21]蒋英，赵蓉，张胜男，等.干扰素释放酶联免疫法(TB-IGRA)用于检测结核分枝杆菌的优越性[J].实用预防医学，2012，19(1)：24-26.

[22]白国峰.T-SPOT.TB法在肺结核分枝杆菌检测中的应用[J].山东医药，2015(42)：72-73.

[23]唐硕润，梁珍.结核酶联免疫斑点试验、结核分枝杆菌DNA测定和痰涂片检测在肺结核诊断中的比较研究[J].中国当代医药，2013(34)：122-123.

[24]王晓娟，周晓霞，王臻，等.外周血结核杆菌感染T细胞斑点试验联合胸腔积液腺苷脱氨酶检测对结核性胸膜炎患者的诊断价值及评价[J].中国医刊，2016，51(6)：29-32.

[25]朱桂云，杨永辉，安晓颖，等.两种γ-干扰素释放试验检测结核菌感染的对比研究[J].河北医药，2013(19).

[26]Chaitra MG，Shaila MS，Nayak R.Detection of interferon gammasecreting CD8+T lymphocytes in humans specific for three PE/PPE proteins of Mycobacterium tuberculosis[J].Microbes Infect，2008，10(8)：858-67.

[27]Butera O，Chiacchio T，Carrara S，et al.New tools for detecting latent tuberculosis infection：evaluation of RD1-specific long-term response[J].BMC Infect Dis，2009，9：182.

[28]周乐亮.T-SPOT.TB联合细胞因子INF-γ、IL-10等检测在结核病诊断中的应用[D].长沙：中南大学，2013.

[29]Millington KA，Innes JA，Hackforth S，et al.Dynamic relationship between IFN-gamma and IL-2 profile of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells and antigen load[J].J Immunol，2007，178 (8)：5217-26.

[30]Ling DI，Pai M，Davids V，et al.Are interferon-{gamma}release assays useful for diagnosing active tuberculosis in a high-burden setting?Eur[J].Respir J，2011，38(3)：649-656.

[31]Druszczynska M，Kowalewicz-Kulbat M，Fol M，et al.Latent M. tuberculosis infection-pathogenesis，diagnosis，treatment and prevention strategies[J].Pol J Microbiol，2012，61(1)：3-10.

[32]Ahmad，S.New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection[J].Respir Res，2010，11：169.

[33]Pai M，Denkinger CM，Kik SV，et al.Gamma interferon release assays for detection of Mycobacterium tuberculosis infection[J].Clin Microbiol Rev，2014，27(1)：3-20.

[34]王震，龚玉华，钱彩娣，等.5种结核杆菌检测方法的临床应用价值[J].检验医学与临床，2015(3)：334-336.

[35]Bobadilla K，Sada E，Jaime ME，et al.Human phagosome processing of Mycobacterium tuberculosis antigens is modulated by interferon-gamma and interleukin-10[J].Immunology，2013，138(1)：34-46.

R446.62，R378.91+1

A

1674-1129(2017)01-0056-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.017

2016-07-05；

2016-11-18)

国家自然科学基金青年基金（81401964）；江西省青年科学基金（20142BAB215058）；江西省教育厅青年基金（GJJ14185）

余建林，男，1990年生，本科；彭琳，女，1994年生，本科。通信作者：陈娟娟，1983年生，博士，副主任医师，E-mail：moonlikecj@163.com；谭立明，南昌大学第二附属医院检验科，教授，1963年生，Email：wangxzlj@126.com