张 青，余以刚，王 成，尹寿伟，刘湘川，周海鹏

(1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640； 2.广东汉肽生物工程有限公司，广东 广州 510640)

蝇蛆营养成分分析及其蛋白提取工艺的研究

张 青1，余以刚1，王 成1，尹寿伟1，刘湘川2，周海鹏2

(1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640； 2.广东汉肽生物工程有限公司，广东 广州 510640)

研究以蝇蛆为原料，通过营养成分及氨基酸组成分析，综合评价其营养价值。同时采用稀碱法提取蝇蛆蛋白，以提取率为指标，利用单因素试验与响应面优化法考察NaOH质量分数、料液比以及提取温度对蛋白提取率的影响。结果表明:蝇蛆蛋白质质量分数为51.73%，必需氨基酸与氨基酸总量比值(E/T)为41.012%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)为69%，均优于FAO/WHO提出的参考蛋白及氨基酸模式。稀碱法提取蛋白最佳工艺为:NaOH质量分数2%、料液比1∶15 g/ml、提取温度60℃。在此最佳工艺条件下蝇蛆蛋白的实际提取率可达58.21%;其中各因素影响程度大小依次为:温度、氢氧化钠质量分数、料液比。

蝇蛆；营养成分；氨基酸评分；蛋白提取；响应面优化

昆虫作为地球上最大的生物群类，不仅蛋白质含量高，而且氨基酸组成比较合理[1]。昆虫蛋白中有丰富的赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸，但色氨酸较低。常规动植物食品中普遍缺乏赖氨酸、蛋氨酸，但色氨酸含量却很高[2-3]。在日常饮食中，赖氨酸和蛋氨酸含量偏低[4]。因此，将昆虫蛋白粉加入到常规食品中混合食用可以相互补充，对于人体合理和全面摄取营养及保障健康具有重要的意义[5]。到目前为止，已用蜂王、蚂蚁、蜜蜂幼虫等开发出多种产品。其中，有蚂蚁制备的口服液和冲剂等功能性产品[6-7]，利用蚕蛹制成的复合氨基酸粉、蛋白粉和运动饮料[8]。

家蝇，属双翅目，蝇科，是昆虫家族中的一大类，种类多、数量大，是一种非常重要的蛋白资源[9-10]。其幼虫即为蝇蛆，是目前蝇蛆蛋白研究的主要材料。因此，利用蝇蛆蛋白进行深加工，开发蛋白粉及氨基酸产品等，提高产品的附加值，是非常必要且有实际意义的工作。目前，工业化生产提取昆虫蛋白的的主要方法有碱法和酶法[11-13]，酶法虽然可保持蛋白质的营养价值和功能，但是提取成本高。碱法效率高，能耗和成本较低，但蛋白会有损失。本研究以蝇蛆为原料，进行营养成分分析和氨基酸组成分析，综合评价蝇蛆的营养价值，并采用稀碱法提取蝇蛆蛋白，响应面优化提取工艺，为蝇蛆蛋白的深加工和功能性食品的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蝇蛆(fly larvae)由中山大学提供；氨基酸标品购于Sigma公司；氢氧化钠(NaOH)、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、盐酸、浓硫酸、硼酸，均为分析纯。

KDN-F自动凯氏定氮仪，上海纤维仪器有限公司；电热恒温(鼓风)干燥箱，上海上迈电子仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，上海广英仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，金坛市白塔金昌实验仪器厂；日立835-50氨基酸分析仪，日本日立公司。

1.2 方法与步骤

1.2.1 原料预处理

将蝇蛆用高速粉碎机粉碎，采用正己烷(固液比1∶10)浸泡48 h脱脂，减压蒸馏回收正己烷。将脱脂的蝇蛆粉50～60℃条件下热风干燥去除残留的溶剂，常温保存。

1.2.2 蝇蛆营养成分分析

水分测定：参照GB 5009.3-2010《食品中水分的测定》，105℃烘箱干燥法；脂肪测定：采用索氏提取法，参照GB/T 5512-2008《食品中脂肪的测定》；蛋白质的测定：利用自动凯氏定氮仪进行粗蛋白质含量测定；灰分的测定：采用灼烧法，参照GB 5009.4-2010《食品中灰分的测定》。

甲壳素类化合物的测定[14]：将脱脂的蝇蛆粉，浸入2%NaOH溶液中，低速搅拌，室温反应4 h，利用纱布过滤，再浸入10%NaOH溶液中，85℃反应4 h，纱布过滤后，水洗至中性，加入2 mol/L盐酸按5∶1 反应1 h，抽滤，水洗至中性。滤渣再经6%H2O2脱色，得到甲壳素类化合物。

1.2.3 氨基酸组成分析及评价

1.2.3.1 氨基酸分析

称取约150 mg蝇蛆粉末至水解管，按1∶1加入6 mol/L盐酸5 ml，酒精喷灯后，于110℃水解24 h。水解后冷却至室温，过滤，用超纯水定容至25 ml量取1 ml样品，置烘箱脱酸，脱至干燥后加入3 ml稀释液混合均匀，并用针管吸取1 ml，经0.22 μm过滤器过滤后装入试剂瓶中，备用[15]。

1.2.3.2 氨基酸营养评价

蝇蛆的氨基酸营养价值的评价采用FAO/WHO建议的每克氨基酸评分标准模式，参考文献方法[16-17]对氨基酸评分(ASS)、化学评分(CS)进行计算，计算公式如下：

1.2.4 蝇蛆蛋白的提取和测定

参照Zhang等[18]的方法并进行改进，取2 g脱脂蝇蛆粉末，按料液比加入一定质量分数的氢氧化钠溶液，混匀，在一定温度下浸提1 h，期间每隔15 min搅拌一次。取出浸提液于4 000 r/min条件下离心10 min，取上清，弃沉淀，并用去离子水定容至100 ml。取一定量的提取液，利用考马斯亮蓝G-250法测定提取液中蛋白质含量，并计算提取率：

1.2.5 单因素试验设定

NaOH质量分数0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/ml)，浸提温度50、60、70、80、90℃。考察单因素时，其它条件固定为：NaOH质量分数1%，料液比1∶15，浸提温度60℃。

1.2.6 蝇蛆蛋白质提取的响应面设计

通过单因素实验，确定因素NaOH质量分数、料液比、提取温度中心水平值分别为2%、1∶15 g/ml、70℃，并采用Box-Behnken中心组合设计原理，以NaOH质量分数(X1)、料液比(X2)、提取温度(X3)做三因素三水平响应面分析试验，并以蛋白质提取率Y为响应值，利用Design Expert 8.0.6软件进行试验设计，共有17个实验，分别为12个析因试验、5个中心点重复试验。试验设计的因素和水平编码见下表1。

表1 实验因素水平和编码

2 结果与讨论

2.1 蝇蛆主要组成成分

蝇蛆的主要组成成分见表2，可以发现蝇蛆的蛋白质和脂肪质量分数很高，分别51.73%和17.92%，具有很高的营养价值。

表2 蝇蛆组成成分分析

2.2 蝇蛆蛋白氨基酸组成及必需氨基酸营养评价

一般蛋白质中所含必需氨基酸的种类、含量及组成比例决定蛋白质的营养价值的高低。蝇蛆蛋白质的氨基酸组成分析及必须氨基酸组成见表3。

从表3可知道，蝇蛆各类氨基酸的种类齐全，共检测到17种，并且人体所需的9种必需氨基酸都存在，其中，色氨酸在样品处理后未检测出。蝇蛆的必需氨基酸占氨基酸总量的40.81%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为0.69，均略高于参考模式的40%和0.6。

蝇蛆蛋白模式及必需氨基酸评价分析见表4。

由表4可见，以FAO/WHO 评分模式和鸡蛋蛋白的必需氨基酸为标准，计算蝇蛆的AAS及CS值，可以发现除了异亮氨酸的氨基酸评分(AAS)略低于FAO/WHO，其余的都高于FAO/WHO的氨基酸评分(AAS)。总之，蝇蛆蛋白质中必需氨基酸含量丰富，营养价值高。

表3 蝇蛆蛋白质氨基酸组成

注：原料经脱脂脱水处理后，进行氨基酸分析；色氨酸未测出；E为必需氨基酸总和；N为非必需氨基酸总和。

表4 蝇蛆蛋白模式及必需氨基酸评价分析

2.3 单因素实验

通过文献[19-21]以及预实验得出，影响稀碱法提取蛋白的主要因素有NaOH质量分数、料液比和浸提温度，故选取这3个因素进行单因素实验，结果见图1～图3。

图1 NaOH质量分数对蝇蛆蛋白提取率的影响

由图1可知，蝇蛆蛋白的提取率随着NaOH质量分数的增加呈先增大后减小的趋势，当NaOH质量分数达到2.0%时，蛋白质提取率达到最大，这可能是因为低质量分数的NaOH不能有效的将蛋白质溶出，高质量分数NaOH会导致蛋白质变性，从而影响蛋白质的提取率。

图2 料液比对蝇蛆蛋白提取率的影响

由图2可知，当料液比为1∶15 g/ml时，蛋白质的溶出量最佳。由图3可知，温度50～70℃时，蛋白质的提取率缓慢上升，并在70℃时达到最大，70～90℃时，蛋白质提取率急剧下降，这可能是由于温度过高导致蛋白质的空间构想发生变化而致其变性沉降，蛋白质的提取率降低。因此，选取NaOH质量分数2%、料液比1∶15、浸提温度70℃作为响应面中心点。

图3 温度对蝇蛆蛋白提取率的影响

2.4 响应面优化提取工艺结果分析

2.4.1 模型建立及显著性分析

以NaOH质量分数(X1)、料液比(X2)、提取温度(X3)为响应变量，以蝇蛆蛋白质提取率(Y)为响应值，响应面分析方案及结果见表5，模型回归方程方差分析见表6。

表5 响应面试验方案设计及结果

表6 模型回归方程方差分析

利用Design-Expert 8.0.6 软件进行多元回归拟合分析，得到回归模型方程如下：

Y=57.88-1.38X1-1.26X2-1.71X3+

0.83X1X2+0.27X1X3+0.37X2X3-

由表6可以看出，模型的P=0.000 2<0.01，模型达到极显著。模型误差失拟P=0.641 9>0.05，该模型失拟不显著，说明该响应面分析方程对试验拟合度较好，可靠性较高。应用该回归模型能够对蝇蛆蛋白质提取效果进行较好地分析和预测。

2.4.2 蝇蛆蛋白提取响应面分析

根据回归方程，作出响应面图，如图4～图6。

图4 蛋白质提取率与NaOH质量分数、提取温度的响应面图

由图4可知，随着因素NaOH质量分数的不断增大，响应值先增大后减小趋势，存在极大值。在NaOH质量分数相同情况下，随着提取温度不断增大，响应面值小幅度下降。

图5 蛋白质提取率与NaOH质量分数、料液比的响应面图

图6 蛋白质提取率与提取温度、料液比的响应面图

由图5可知，随着NaOH质量分数和料液比的数值不断增大，响应面的值都是先增大后减小，在NaOH质量分数和料液比的中心点附近蛋白质提取率有最大值，此时蛋白质的提取率最大。综上所述，当温度确定为某一值不变时，NaOH质量分数和料液比都在中心点附近时，蛋白质的提取率比较高，有利于蛋白的提取，回归方程有最优水平。

2.4.3 最佳提取条件的确定及验证

将回归方程对X1、X2、X3分别取一阶偏导数等于零，进行解方程，得到最优提取条件为NaOH质量分数1.91%、温度60℃、料液比1∶14.48，理论提取率58.98%。根据实际情况调整为NaOH质量分数2%、温度60℃、料液比1∶15，在此条件下进行验证性实验，得到的蛋白质的提取率为(58.21±0.10)%，模型预测值与试验实际值相对偏差较小，说明本实验所选模型具有很高的拟合性。

3 结论

本研究通过测定蝇蛆蛋白氨基酸组成成分，参考FAO/WHO的蛋白理想模式对蝇蛆氨基酸营养评价，蝇蛆蛋白质的必需氨基酸占总氨基酸40.81%，必需氨基酸占与非必需氨基酸的比值为0.69，都优于FAO/WHO蛋白理想模式的40%和0.60。

通过单因素试验分析了稀碱法提取蝇蛆蛋白的最优条件，并在此基础上采用Box-Behnken响应面试验设计得到最佳提取工艺：NaOH质量分数2%；提取温度60℃；料液比1∶15 g/ml。在此条件下，蛋白质的提取率达到(58.21±0.10)%，建立的回归模型能很好地预测蝇蛆蛋白提取率。

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(责任编辑：梅 竹)

Nutrition components analysis of fly larvae and its protein extraction process

ZHANG Qing1,YU Yi-gang1,WANG Cheng1,YIN Shou-wei1，LIU Xiang-chuan2，ZHOU Hai-peng2

(1.College of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Hantai Bio-engineering Co.Ltd.,Guangzhou 510640,China)

For the nutritional evaluation of fly larvae,comprehensive evaluation of the nutritional value of fly larvae was assessed through the nutritional content and amino acid composition analysis.By dilute alkali extraction method,with the extraction rate as index,using single factor experiment and the response surface optimization method,the effects of NaOH concentration,solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of protein was studied.The results showed that the protein content of fly larvae was 51.73%,among which the ratio of E/T (essential amino acid/ total amino acid) was 41.01% and E/N (essential amino acid/non-essential amino acid) was 69%,both much better than the protein standard suggested by FAO/WHO.The protein extraction yield under the optimization condition was 58.21% and the optimized protein extraction process using alkaline solution were as follows: 2% of sodium hydroxide,1∶15 of solid-liquid ratio and reaction temperature of 60℃.Among which,the parameters which affected the protein yield in descend order were temperature,the concentration of sodium hydroxide and solid-liquid ratio.

fly larvae;nutritional content;amino acid score;protein extraction;response surface methodology

2016-01-03；

2017-02-15

广东省科技计划项目(2016B090918103)。

张 青(1993-)，男，硕士，研究方向为食品质量与安全。

余以刚(1968-)，男，教授，，研究方向为食品质量与安全。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.03.009

S816.9

A

1003-6202(2017)03-0033-05