胡桃楸总鞣质的小鼠体内抗肿瘤作用研究

2017-03-21王添敏俞文婕付莹

中国医药导报 2017年3期

王添敏　俞文婕　付莹

[摘要] 目的研究胡桃楸總鞣质的体内抗肿瘤活性。方法采用70%丙酮超声提取胡桃楸中总鞣质。采用荷H22肝癌实体瘤小鼠模型评价胡桃楸的抗肿瘤活性。将50只ICR小鼠随机分为正常组，模型组，环磷酰胺阳性对照组，总鞣质低、高剂量组，每组各10只。正常组小鼠右腋下接种PBS（0.2 mL/只），其余各组小鼠均于右腋下接种等体积的小鼠H22肝癌细胞悬液（2×106个/mL）。接种24 h后给药，总鞣质低（0.09 g/kg）、高剂量（0.18 g/kg）组分别灌胃给予低浓度和高浓度的总鞣质提取物，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液（0.03 g/kg），正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水。连续给药10 d后，处死小鼠，以瘤重和抑瘤率为指标研究胡桃楸总鞣质对H22肝癌实体瘤的抑制作用，以免疫器官指数、外周血象和肝功能为指标研究胡桃楸总鞣质对荷瘤机体生存质量的影响。结果胡桃楸总鞣质的得率为5.07%，纯度为92.8%。与模型组比较，胡桃楸总鞣质低、高剂量组肿瘤重量明显降低（P < 0.05），均显示较明显的抗肿瘤作用，抑瘤率分别为34.22%和36.92%。在抑制肿瘤生长的同时，胡桃楸总鞣质未显示环磷酰胺所致的体重降低、免疫抑制和杀伤白细胞等副作用。结论胡桃楸总鞣质具有较好的抗肿瘤作用，且无免疫抑制和杀伤白细胞等副作用。

[关键词] 胡桃楸；总鞣质；小鼠肝癌；抗肿瘤

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（c）-0016-04

[Abstract] Objective To evaluate the in vivo anti-tumor activity of the total tannins from Juglans mandshurica. Methods Total tannins from Juglans mandshurica was extracted by 70% acetone. Mice bearing murine-hepatocarcinoma （H22） model was established to evaluate the anti-tumor activity. Totally 50 ICR mice were randomly divided into five groups with 10 mice in each group： normal control group， model control group， cyclophosphamide group （as positive control）， and total tannins low， high dose group. The normal control group was subcutaneously injected with PBS （0.2 mL per mouse）， while the other four groups were subcutaneously injected with murine-hepatocarcinoma （H22） cell suspension （2×106/mL）. 24 h after injection， total tannins low， high dose group was intragastrically administered with total tannins at low （0.09 g/kg） and high dosage （0.18 g/kg）. Cyclophosphamide group was given with cyclophosphamide （0.03 g/kg） by intraperitoneal injection. Normal and model control groups were intragastrically administered with water. After continuous administration for 10 d， killed mice， tumor weight and tumor inhibition ratio were obtained for the evaluation of the anti-tumor activity. Immune organ index， hematological parameters and Hepatic functions were determined to estimate the protective effects of total tannins on normal functions of H22 tumor bearing mouse. Results The yield of tannins from Juglans mandshurica was 5.07%， and the purity of the tannins was 92.8%. Total tannins from Juglans mandshurica showed inhibitory effect on the growth of tumor tissues. The inhibitory ratio of total tannins low and high dose group were 34.22% and 36.92%， respectively. Total tannins from Juglans mandshurica did not exhibit side effects， which are typical of cyclophosphamide， such as loss of body weight， immune suppression and killing white blood cell. Conclusion Total tannins from Juglans mandshurica was effective in anti-tumor， and did not exhibit side effects of immune suppression and killing white blood cell.

[Key words] Juglans mandshurica； Total tannins； Murine-hepatocarcinoma； Anti-tumor activity

胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）为胡桃科（Juglandaceae）植物，属落叶乔木，在我国东北和华北地区资源丰富。根据文献记载，胡桃楸具有补肺益肾、滋阴助阳和抗癌等功效[1-2]，民间采用胡桃楸的水煎剂治疗肿瘤[3]。胡桃楸中主要含有鞣质和萘醌类成分[4-6]，但是经过加热后，其中的萘醌类成分多已挥发[7]，水煎剂中主要含鞣质类成分。有学者研究表明，胡桃楸中的鞣质类化合物前体没食子酸[8]和逆没食子酸[9]能够抑制肿瘤细胞的增殖。因此，本实验制备了胡桃楸总鞣质提取物，研究了胡桃楸总鞣质的抗肿瘤作用，为胡桃楸的抗肿瘤药效物质基础研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试药胡桃楸枝样品于2011年7月采自辽宁省普兰店市莲山镇，由辽宁中医药大学翟延君教授通过原植物形态和性状特征鉴定为胡桃科植物胡桃楸Juglans mandshurica Maxim.。标本编号201107ZHI01，保存于辽宁中医药大学研发中心F205。

阳性对照环磷酰胺（cyclophosphamide）纯度>98%，购于大连美仑生物，批号20130326。

1.1.2 实验动物和瘤株 SPF级ICR小鼠，6～8周龄，体重（18～22 g），雌雄各半，购于大连医科大学实验动物中心，合格证号：SCXX（辽）2012-0002。饲养于本实验室动物饲养室，环境温度20～25℃、湿度40%～60%。H22小鼠肝癌瘤株购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.3 仪器和试剂胎牛血清、PBS缓冲液和RPMI-1640培养基购自美国Gibco生命技术有限公司。ALPHA1-4LSC冷冻干燥机购自德国Marin christ公司，YXQSG46-280压力蒸汽消毒器购自宁波久兴医疗器械有限公司，HD2-BCN-1360B生物洁净工作台购自哈尔滨东联电子技术有限公司，NUAIRE AUTOFLOW CO2培养箱购自美国纽艾公司。BC-2600vet全自动血液分析仪购自迈瑞公司，7020全自动生化分析仪购自株式会社日立制作所。

1.2 方法

1.2.1 胡桃楸总鞣质的制备胡桃楸茎枝切片后冷冻干燥、粉碎、过40目筛。取胡桃楸茎枝粉末100 g于锥形瓶中，加10倍体积的70%丙酮，超声提取40 min，冷凝水维持水温20℃，滤过，滤液转移至圆底烧瓶中，回收溶剂至无丙酮味，冷冻干燥。密封保存于4℃冰箱中。临用前用蒸馏水配置成低（9 mg/mL）、高（18 mg/mL）2种不同浓度的溶液。

1.2.2 胡桃楸总鞣质纯度的测定精密称取胡桃楸总鞣质提取物25 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。按照本课题组建立的方法[10]分别测定供试品溶液中总多酚和游离多酚的含量，计算总鞣质的含量。从而计算胡桃楸总鞣质提取物的纯度。

1.2.3 小鼠H22肝癌实体瘤模型的建立取-80℃下冻存的H22小鼠肝癌细胞，按常规方法进行复苏和小鼠体内传代培养。无菌条件下剖取体内传至第四代，接种7 d生长良好的H22肝癌小鼠腹水，用PBS稀释9倍后计数，台酚蓝拒染法测定细胞活性，活细胞率≥95%，并根据计数结果调整离心管中的腹水浓度，使细胞浓度为2×106个/mL。吸取细胞悬液，以0.2 mL/只注射于小鼠右腋下[11-12]。

1.2.4 分组和给药接种24 h后，将小鼠完全随机分为4组，每组10只。模型组灌胃给予蒸馏水，总鞣质低（0.09 g/kg）、高（0.18 g/kg）剂量组分别灌胃给予低浓度（9 mg/mL）和高浓度（18 mg/mL）的总鞣质提取物，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液（3 mg/mL）。另设10只右腋下注射0.2 mL/只PBS的ICR小鼠作为正常组，灌胃给予蒸馏水。各组小鼠分笼喂养，自由饮水与摄食，每天给药1次，灌胃和腹腔注射体积均为10 mL/kg，连续给药10 d。

1.2.5 血液样品的处理末次给药24 h后，称小鼠体重，眼眶静脉丛采血。在采集的过程中将其分成两部分：约0.1 mL静脉血收集于吸附有EDTA-二钾的EP管，做为抗凝血；剩余血液直接收集于EP管中，做为非抗凝血。

抗凝血检测小鼠白细胞数目、血小板数目和血红蛋白含量等血象指标。非抗凝血静置30 min，37℃水浴孵育30 min，850转/min，离心10 min，用移液枪吸取血清，检测各组小鼠血清中總蛋白、白蛋白和碱性磷酸酶等肝功能指标。

1.2.6 组织样品的收集与处理小鼠采血后，颈椎脱臼处死，剥离肿瘤，剖取胸腺、脾脏，称量各组织重量并记录。计算各组抑瘤率、10 g体重胸腺指数和10 g体重脾脏指数。计算方法如下：

抑瘤率（%）=（模型组瘤重-实验组瘤重）/模型组瘤重×100%，

胸腺指数=10×胸腺重（mg）/体重（g）×100%，

脾脏指数=10×脾脏重（mg）/体重（g）×100%。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胡桃总鞣质的纯度

根据鞣质易溶于丙酮的性质，采用70%丙酮超声提取，胡桃楸总鞣质的得率为5.07%。采用磷钼钨酸显色的方法测定胡桃楸总鞣质中鞣质的含量为928.01 mg/g，胡桃楸总鞣质的纯度为92.8%。

2.2 胡桃楸总鞣质对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

模型组小鼠平均瘤重为1.23 g，模型建立成功。胡桃楸总鞣质对H22荷瘤小鼠肿瘤生长具有显著抑制作用（图1、表1），低、高剂量组小鼠的瘤重显著低于模型组（P < 0.05），抑瘤率分别为34.22%和36.92%。阳性对照组小鼠的瘤重也显著低于模型组（P < 0.05），抑瘤率达91.52%。

2.3 胡桃楸总鞣质对H22荷瘤小鼠免疫器官和体重的影响

与正常组比较，模型组小鼠的胸腺指数显著降低（P < 0.05）（表1）。胡桃楸总鞣质低剂量组的胸腺指数仍显著低于正常组（P < 0.05），而总鞣质高剂量组的胸腺指数则趋于正常，与正常组无统计学意义差异（P > 0.05）。模型组小鼠的脾脏指数略高于正常组，但差异无统计学意义（P > 0.05），胡桃楸总鞣质低、高剂量组小鼠的脾脏指数也与正常组无统计学意义差异（P > 0.05）。

实验结束时，阳性对照组小鼠的体重降低（表1），其余各组小鼠体重均正常增长，各组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。阳性对照组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著低于模型组和正常组（P < 0.05）。

2.4 胡桃楸总鞣质对H22荷瘤小鼠外周血象的影响

模型组小鼠的白细胞数显著高于正常组（P < 0.05）。给予不同剂量的胡桃楸总鞣质后，总鞣质高剂量组小鼠白细胞数接近正常水平，与正常组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

模型组小鼠的血小板数显著高于正常组小鼠（P < 0.05）。给予不同剂量的胡桃楸总鞣质后，血小板数有降低的趋势，其中总鞣质高剂量组小鼠的血小板数与正常组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

模型组小鼠血红蛋白含量显著低于正常组小鼠（P < 0.05）。给予不同剂量的胡桃楸总鞣质和环磷酰胺后，各组小鼠血红蛋白含量仍显著低于正常值（P < 0.05）。见表2。

环磷酰胺组小鼠的总白细胞数目显著低于正常组、模型组和其他给药组（P < 0.05）。见表2。

2.5 胡桃楸总鞣质对H22荷瘤小鼠肝功能的影响

模型组小鼠与正常组小鼠比较，总蛋白、白蛋白、白球比和碱性磷酸酶含量显著降低（P < 0.05）（表3），荷瘤小鼠可能存在肝功能损伤。给予不同剂量的胡桃楸总鞣质和环磷酰胺后未见显著好转，推测胡桃楸总鞣质和环磷酰胺对小鼠因荷瘤而引起的肝功能损伤无明显改善作用。

3 讨论

民间采用胡桃楸水煎液治疗肿瘤[3，13]，关于胡桃楸的抗肿瘤研究较多[14-17]。胡桃楸中主要成分包括萘醌和鞣质[4-6]。有文献报道胡桃楸中胡桃醌等萘醌类成分具有抗肿瘤作用[18]，但胡桃醌不稳定[6，19]，胡桃楸水煎液中检测不到胡桃醌，而主要含有鞣质类成分。未见文献报道胡桃楸鞣质的抗肿瘤作用，因此本文采用70%丙酮超声提取胡桃楸中总鞣质，对其抗肿瘤作用进行了研究。

结果显示胡桃楸总鞣质具较好的抗肿瘤作用，低剂量和高剂量的抑瘤率分别为34.22%、36.92%。胡桃楸总鞣质低（0.09 g/kg）、高剂量（0.18 g/kg）的抑瘤率接近，在预实验中测定了胡桃楸总鞣质剂量为0.18 g/kg和0.36 g/kg时，抑瘤率分别为40%和5%。本文和预实验的结果说明胡桃楸总鞣质的抗肿瘤作用不呈量效关系，高剂量时抑瘤率增加不明显（0.18 g/kg）甚至降低（0.36 g/kg）。这可能由于胡桃楸总鞣质中成分复杂，其中含有抗肿瘤的成分，也可能含有促进肿瘤生长的成分。低剂量（0.09 g/kg）时，抗肿瘤的成分发挥主要作用，而促进肿瘤生长的成分作用较弱；高剂量（0.18 g/kg）时，抗肿瘤的成分发挥主要作用，促进肿瘤生长的成分也发挥了一定作用，使得该剂量的抑瘤率与低剂量接近；更高剂量（0.36 g/kg）时，促进肿瘤生长的成分发挥了主要作用，造成该剂量的抑瘤率反而降低。因此，有必要深入研究并寻找胡桃楸总鞣质中的抗肿瘤有效成分，剔除无效成分。

阳性对照（环磷酰胺）组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著低于模型组和正常组（P < 0.05），说明环磷酰胺具有明显副作用。同时环磷酰胺组小鼠的总白细胞数目显著低于正常组、模型组和其他给药组（P < 0.05），这与临床上环磷酰胺杀伤白细胞的副作用一致[20-23]。以上说明环磷酰胺虽较胡桃楸总鞣质具有较高的抑瘤率，但具有明显的副作用，能使小鼠体重降低、白细胞数减少、免疫器官指数降低。

在机体正常功能方面，胡桃楸总鞣质低、高剂量组小鼠体重、免疫器官指数与正常组小鼠无显著差异（P > 0.05），白细胞数目未减少。胡桃楸总鞣质高剂量还能改善荷瘤小鼠血红蛋白含量降低、血小板數目升高的症状。说明胡桃楸总鞣质在抑制肿瘤生长的同时无明显的副作用，具有天然抗肿瘤药物副作用低的优势，值得深入研究其抗肿瘤有效成分或有效组分。

[参考文献]

[1] 贾敏如，李星炜.中国民族药志药[M].北京：中国医药科技出版社，2005：354.

[2] 李凡，郑鹏飞，郑永光，等.核桃楸皮提取物在乙型肝炎后肝癌治疗中的展望[J].中国当代医药，2015，22（11）：15-20.

[3] 张洪娟，桑树荣，高奎滨.高奎滨用青龙衣制剂治疗肿瘤用药经验[J].黑龙江中医药，2000，29（2）：62.

[4] 沈广志，邹桂华，梁婷，等.胡桃楸的化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（17）：219-224.

[5] 周媛媛，王栋，牛峰.抗肿瘤中药青龙衣化学成分的研究[J].中草药，2010，41（1）：11-14.

[6] 王金兰，张淑霞，李铁军，等.山核桃树皮化学成分研究[J].中草药，2008，39（4）：490-493.

[7] 王添敏，刘力，邸学，等.不同干燥方法对胡桃楸茎枝中胡桃醌含量的影响[J].中国医院药学杂志，2011，31（17）：1461-1463.

[8] 罗强，任鸿，孙黎，等.没食子酸诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的机制[J].中国老年学杂志，2015，35（9）：4755-4756.

[9] Lin SS. Ellagica acid inhibits arylamine N-acetyltransferase activity and DNA adduct formation in human bladder tumor cell lines（T24 and TSGH8301） [J]. Urological Research，2001，29（6）：371-376.

[10] 王添敏，孙晓丽，彭雪，等.胡桃楸根、茎枝、叶和果皮中总鞣质的含量测定[J].中国中药杂志，2011，36（1）：32-36.

[11] 张莉莉，陈伟，梁国强.北虫草素对体外小鼠肝癌H22细胞增殖及肝癌鼠血清中IL-2/TNF-α水平的影响[J].吉林中医药，2015，35（2）：184-186.

[12] 陈丽，张安文，罗宇，等.柿叶不同极性部位对H22腹水瘤及H22，S180实体瘤小鼠的抑瘤作用[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（1）：167-173.

[13] 梁启超，邹桂华，刘爽，等.核桃楸皮多糖的分离纯化及抗癌活性研究[J].天然产物研究与开发，2015，27（8）：1340-1345.

[14] 常乐，孟楠，雷涛，等.核桃楸皮药理作用的研究概述[J].中国医药导报，2013，10（1）：23-24.

[15] 邹品文，赵春景，尹小燕，等.核桃楸树皮提取物的抗肿瘤作用[J].中国医院药学杂志，2010，30（4）：308-310.

[16] 古乐，曹秀格，李岩.胡桃楸树皮抗肿瘤有效成分对H22荷瘤小鼠T 细胞亚群的影响[J].科技导报，2016，34（11）：37-41.

[17] 索轶平，李天娇，孟宪生，等.木鸡颗粒中核桃楸皮总黄酮诱导肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡及其初步作用机制研究[J].中药材，2016，39（10）：2387-2390.

[18] 方芳，赵良中，李强，等.胡桃醌对卵巢癌SKOV3细胞氧化应激和凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2016， 32（1）：156-159.

[19] 孙墨珑，王艳梅，宋湛谦，等.核桃楸乙醇提取物的稳定性[J].东北林业大学学报， 2008，36（5）：53-54.

[20] 顾洪伟，陈琦，张炜，等.小鼠原发性肝癌建模方法的优化[J].中国实验动物学报，2016，24（1）：20-24.

[21] 杨喜花，王国平，任连生，等.加味当归补血中药对环磷酰胺所致小鼠白细胞减少的影响[J].中国药物与临床，2015，15（1）：36-38.