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甾体类化合物免疫抑制毒性体外筛选终点指标的选择研究

2017-03-20宋秀春吕金艳

临床医药文献杂志(电子版) 2017年91期
关键词:调节作用脾脏活化

宋秀春⋆,吕金艳

(呼伦贝尔市人民医院体检科,内蒙古 呼伦贝尔 021008)

地塞米松是一种具有强免疫抑制作用的糖皮质激素类化合物,广泛用于各种炎症性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病及器官移植排斥的治疗。在药物开发中,地塞米松被作为免疫调节药物研究的阳性药[1-3]。

经过长期研究,地塞米松对于各种免疫细胞的调节作用已经积累大量数据,其中地塞米松对于CD4+T细胞活化、增殖和分化的抑制作用也是很明确的。然而,地塞米松对于CD4+T细胞活化标志物的调节作用研究不够明确,特别是对于CD69的表达调节作用还存在矛盾的结果。因此,进一步研究地塞米松对于CD4+T细胞活化标志物的调节作用,对于利用流式细胞术研究免疫调节药物对于CD4+T细胞活化具有重要意义。本研究将利用流式细胞术分析地塞米松对于CD4+T细胞活化标志物CD69和CD25的调节作用

1 仪器与材料

1.1 仪器

流式细胞仪:购自BDBiosciences公司(FACSCantoTMⅡ)。

1.2 动物

8周龄雄性Balb/c小鼠,购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.3 试剂

仓鼠抗小鼠CD3e和CD28抗体(货号:BR31101和BR31103),购自北京佰瑞达生物科技有限公司;大鼠抗小鼠单克隆抗体FITC-CD69、PECD25和PE-CY7-CD4 (货号:553237、558642、552775),购自BD Biosciences公司;地塞米松(货号:D1756),购自Sigma-Aldrich公司。

2 方 法

2.1 小鼠脾脏白细胞制备

无菌取小鼠脾脏放入70 μM无菌滤网中,用5 mL注射器内芯研磨,并用20 mL的PBS冲洗,获得小鼠脾脏细胞悬液;然后200 g离心5分钟,弃上清,加入10 mL红细胞裂解液裂解红细胞,然后加入20 mL RPMI1640培养基终止裂解,200 g离心5分钟,弃上清;再利用10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞,然后200 g离心5分钟,弃上清;最后再利用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞(含氨苄青霉素和链霉素),并通过细胞计数将细胞浓度稀释到1×107个/mL。

2.2 流式细胞术测定CD4+ T细胞活化标志物

利用PBS稀释大鼠抗小鼠CD3e抗体到2 μg/mL,加入24孔板,每孔250 μL,4℃包被过夜;将小鼠脾脏白细胞接种到未包被抗体24孔板中,1×106个/孔,作为对照组,将细胞接种到包被抗体的24孔板中,作为模型组和地塞米松组,加入大鼠抗小鼠CD28抗体至终浓度为2 μg/mL;在地塞米松组加入地塞米松至终浓度为10 μM;37℃,5% CO2条件下继续培养24小时;然后收集细胞按说明书标记大鼠抗小鼠单克隆抗体FITC-CD69、PE-CD25和PE-CY7-CD4,利用流式细胞仪检测CD4+T细胞表面CD69和CD25的表达。

2.3 统计分析

数据资料均用平均值±标准差(M±SD)表示,所有实验均重复至少三次;利用GraphPad 5.0进行统计分析,Student’s t检验分析组间差异;P<0.05被设定为具有统计学差异。利用Flowjo7.6.1处理流式细胞图。

3 结 果

3.1 地塞米松对CD4+ T细胞活化标志物CD69的调节作用

经流式细胞测定,CD4+T细胞受大鼠抗小鼠CD3e/CD28抗体刺激后,CD69的表达均显著上升,地塞米松对CD69表达上调无显著抑制作用(P>0.05),如图1所示。

图1 地塞米松(DEX)对CD4+ T细胞活化标志物

CD69的调节作用测定。小鼠脾脏白细胞接种到包被大鼠抗小鼠CD3e抗体的24孔板中,加入或不加入地塞米松处理,再加入大鼠抗小鼠CD28抗体,培养24 h,利用流式细胞术测定CD4+T细胞表面CD69(A,B)表达。#P<0.05 vs Control;*P<0.05 vs Model。

3.2 地塞米松对CD4+ T细胞活化标志物CD25的调节作用

经流式细胞测定,CD4+T细胞受大鼠抗小鼠CD3e/CD28抗体刺激后,CD25的表达均显著上升,地塞米松对CD25表达上调具有显著抑制作用(P<0.05),如图2所示。

图2:地塞米松(DEX)对CD4+ T细胞活化标志物

CD25的调节作用测定。小鼠脾脏白细胞接种到包被大鼠抗小鼠CD3e抗体的24孔板中,加入或不加入地塞米松处理,再加入大鼠抗小鼠CD28抗体,培养24 h,利用流式细胞术测定CD4+T细胞表面CD25(A,B)表达。#P<0.05 vs Control;*P<0.05 vs Model。

4 讨 论

CD4+T细胞是哺乳动物及人类发挥适应性免疫功能的重要细胞。CD4+T细胞又称为辅助型T细胞,在接受抗原提呈细胞MHCⅡ类分子提呈的抗原刺激及共刺激信号后迅速活化,细胞表面CD69,CD25等活化标志物迅速上调,利用流式细胞术可以方便地监测CD4+T细胞活化[4-7]。

本研究主要研究具有广谱免疫抑制作用阳性药地塞米松对CD4+T细胞活化标志物CD69和CD25的调节作用,从而为新型免疫抑制剂的免疫调节作用研究提供参考。研究结果表明地塞米松对CD4+T细胞表面CD69上调无抑制作用,而对CD25上调具有显著抑制作用;因此,如果利用流式细胞筛选免疫抑制剂,特别是甾体类化合物,适合选择CD25表达量为CD4+T细胞抑制作用的终点指标。

[1]Sitaula S,Burris T P.Cholesterol and other steroids [J].Encyclopedia of Cell Biology,2016,1: 173-179.

[2]Ferreira J F,Mohamed A A,Emery P.Glucocorticoids and Rheumatoid Arthritis [J].Rheumatic Diseases Clinics of North America,2016,42 (1): 33-46.

[3]Zennaro M C,Boulkroun S,Fernandes-Rosa F.Inherited forms of mineralocorticoid hypertension.Best Practice & Research Clinical Endocrinology &Metabolism,2015,29(4): 633-645.

[4]Tiwari N,Gupta V K,Pandey P,et al.Adjuvant effect of Asparagus racemosus wild derived saponins in antibody production,allergic response and pro-in fl ammatory cytokine modulation [J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2017,86:555-561.

[5]Gasteiger G,Rudensky A Y.Interactions between innate and adaptive lymphocytes [J].Nature Reviews Immunology,2014,14: 631-639.

[6]Netea M G,Joosten L A B,Meer J W M,et al.Immune defense against Candida fungal infections [J].Nature Reviews Immunology,2015,15: 630-642.

[7]Dendrou C A,Fugger L,Friese M A.Immunopathology of multiple sclerosis [J].Nature Reviews Immunology,2015,15: 545-558.

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